Sterylizacja końcówek pipet i probówek EP itp.

1. Przygotuj 0,1% (jedna tysięczna) DEPC (wysoce toksyczna substancja) z wodą dejonizowaną, użyj go ostrożnie pod wyciągiem i przechowuj w temperaturze 4°C z dala od światła;

Woda DEPC to czysta woda uzdatniona DEPC i sterylizowana przez wysoką temperaturę i wysokie ciśnienie.Testowany pod kątem obecności RNaz, DNaz i proteinaz.

2. Włóż końcówkę pipety i rurkę EP do 0,1% DEPC i upewnij się, że końcówka pipety i rurka EP są wypełnione 0,1% DEP.

3. Chronić przed światłem, odstawić na noc (12-24h)

4. Pudełko zawierające końcówkę i rurkę EP nie musi być moczone w DEPC.Po zgrubnym usunięciu wody DEPC z końcówki lub rurki EP zapakuj ją i zawiń.

5. 121 stopni Celsjusza, 30 min

6. 180 stopni Celsjusza, suszyć przez kilka godzin (minimum 3 godziny)

Nie herbata.Podczas pracy z DEPC należy nosić lateksowe rękawiczki i maski!b lub bez sterylizacji DEPC, 130 ℃, autoklaw 90 min (wiele laboratoriów dwukrotnie sterylizuje w wysokiej temperaturze)

Uwagi dotyczące ekstrakcji RNA

Dwa główne zjawiska niepowodzenia izolacji tkankowego RNA

degradacja RNA i pozostałości zanieczyszczeń w tkankach,jeśli chodzi o degradację, przyjrzyjmy się najpierw, dlaczego RNA wyekstrahowany z hodowanych komórek nie ulega łatwej degradacji.Wszystkie istniejące odczynniki do ekstrakcji RNA zawierają składniki, które szybko hamują RNazę.Dodaj lizat do hodowanych komórek i po prostu wymieszaj, wszystkie komórki można dokładnie wymieszać z lizatem, a komórki zostaną całkowicie zlizowane.Po lizie komórek aktywne składniki lizatu natychmiast hamują wewnątrzkomórkową RNazę, dzięki czemu RNA pozostaje nienaruszony.To znaczy, ponieważ hodowane komórki mają łatwy i pełny kontakt z lizatem, ich RNA nie ulega łatwej degradacji;z drugiej strony RNA w tkance łatwo ulega degradacji, ponieważ komórki w tkance nie są łatwe do szybkiego kontaktu z lizatem.dzięki wystarczającemu kontaktowi.Więc,zakładając, że istnieje sposób na przekształcenie tkanki w pojedynczą komórkę przy jednoczesnym hamowaniu aktywności RNA, problem degradacji można by całkowicie rozwiązać.

Najbardziej efektywną metodą jest mielenie ciekłym azotem.Jednak metoda mielenia ciekłym azotem jest bardzo kłopotliwa, zwłaszcza przy dużej liczbie próbek.To dało początek następnej najlepszej rzeczy: homogenizatorowi.Thehomogenizatormetoda nie bierze pod uwagę kwestii, w jaki sposób aktywność RNazy jest hamowana przed kontaktem komórek z lizatem, ale raczej modli się, aby tempo niszczenia tkanki było szybsze niż tempo, w jakim wewnątrzkomórkowa RNaza degraduje RN.

Efekt elektrycznego homogenizatora jest lepszy,a efekt homogenizatora szklanego jest słaby, ale ogólnie metoda homogenizatora nie może zapobiec zjawisku degradacji.Dlatego, jeśli ekstrakcja jest zdegradowana, do rozdrabniania ciekłym azotem należy użyć oryginalnego homogenizatora elektrycznego;oryginalny homogenizator szklany należy zamienić na homogenizator elektryczny lub bezpośrednio zmielić ciekłym azotem.Problem prawie w 100% wykonalny.rozwiązać.

Problem pozostałości zanieczyszczeń wpływający na kolejne eksperymenty ma bardziej zróżnicowane przyczyny niż degradacja, a rozwiązania są odpowiednio różne.Podsumowując,jeśli w tkance występuje degradacja lub pozostałości zanieczyszczeń, należy zoptymalizować metodę ekstrakcji/odczynnik dla określonego materiału doświadczalnego.Nie musisz wykorzystywać swoich cennych próbek do optymalizacji: możesz kupić na targu kilka małych zwierząt, takich jak ryby/kurczęta, wziąć odpowiednią część materiału do ekstrakcji RNA, a drugą część do ekstrakcji białka – zmielić ustami, żołądkiem i jelitami Ekstrakt.

Docelowy RNA wyekstrahowanego RNA jest używany do różnych dalszych eksperymentów, a jego wymagania jakościowe są różne

konstrukcja biblioteki cDNA wymaga integralności RNA bez pozostałości inhibitorów reakcji enzymatycznych;Northern wymaga większej integralności RNA i niższych wymagań dotyczących reszt inhibitorów reakcji enzymatycznych;RT-PCR nie wymaga zbyt dużej integralności RNA,ale hamuje reakcje enzymatyczne.Wymagania dotyczące pozostałości są surowe.Wejście określa wyjście;za każdym razem, gdy celem jest uzyskanie RNA o najwyższej czystości, będzie to kosztować ludzi i pieniądze.

Pobieranie/przechowywanie próbek

Czynniki wpływające na degradację Po opuszczeniu przez próbkę żywego organizmu/lub pierwotnego środowiska wzrostu, endogenne enzymy w próbce zaczną rozkładać RNA,a szybkość degradacji jest związana z zawartością enzymów endogennych i temperaturą.Tradycyjnie istnieją tylko dwa sposoby całkowitego zahamowania aktywności enzymów endogennych: natychmiastowe dodanie lizatu i dokładne i szybkie homogenizowanie;pokroić na małe kawałki i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.Oba podejścia wymagają szybkiego działania.Ten ostatni nadaje się do wszystkich próbek, podczas gdy ten pierwszy jest odpowiedni tylko do tkanek o niskiej zawartości komórek i enzymów endogennych oraz łatwiejszych do homogenizacji.W szczególności tkankę roślinną, wątrobę, grasicę, trzustkę, śledzionę, mózg, tkankę tłuszczową, tkankę mięśniową itp. najlepiej zamrozić w ciekłym azocie przed przystąpieniem do dalszych czynności.

Fragmentacja i homogenizacja próbek

Czynniki wpływające na degradację i wydajność Fragmentacja próbki jestdo dokładnej homogenizacji, co oznacza całkowite i całkowite uwolnienie RNA.Komórki można bezpośrednio homogenizować bez ich rozbijania.Tkanki można homogenizować dopiero po rozbiciu.Drożdże i bakterie muszą zostać rozbite odpowiednimi enzymami, zanim będą mogły zostać zhomogenizowane.Tkanki o niższej zawartości enzymów endogennych i łatwiejszej homogenizacji mogą być kruszone i homogenizowane jednorazowo w lizacie za pomocą homogenizatora;tkanka roślinna, wątroba, grasica, trzustka, śledziona, mózg, tłuszcz, tkanka mięśniowa i inne próbki, są bogate w enzymy endogenne lub nie są łatwo homogenizowane,dlatego rozerwanie tkanki i homogenizację należy przeprowadzić oddzielnie.Najbardziej niezawodną i najbardziej wydajną metodą rozdrabniania jest mielenie ciekłym azotem, a najbardziej niezawodną metodą homogenizacji jest zastosowanie homogenizatora elektrycznego.Specjalna uwaga dotycząca mielenia ciekłym azotem: próbki nie wolno rozmrażać podczas całego procesu mielenia, ponieważ po zamrożeniu istnieje większe prawdopodobieństwo, że enzymy endogenne będą działać.

Wybór lizatu

Wpływ na wygodę obsługi oraz czynniki resztkowych zanieczyszczeń endogennych Powszechnie stosowane roztwory do lizy mogą niemal hamować aktywność RNazy.Dlatego kluczowym punktem wyboru roztworu do lizy jest rozważenie w połączeniu z metodą oczyszczania.Jest jeden wyjątek:w przypadku próbek o wysokiej zawartości enzymów endogennych zaleca się stosowanie lizatu zawierającego fenol w celu zwiększenia zdolności do inaktywacji enzymów endogennych.

Wybór metody oczyszczania

Czynniki wpływające na resztkowe zanieczyszczenia endogenne, szybkość ekstrakcji W przypadku czystych próbek, takich jak komórki, zadowalające wyniki można uzyskać niemal każdą dostępną metodą oczyszczania.Ale w przypadku wielu innych próbek, zwłaszcza tych o wysokim poziomie zanieczyszczeń, takich jak rośliny, wątroba, bakterie itp., wybór odpowiedniej metody oczyszczania ma kluczowe znaczenie.Kolumnowa metoda oczyszczania wirówkowego charakteryzuje się dużą szybkością ekstrakcji i może skutecznie usuwać zanieczyszczenia, które wpływają na późniejszą reakcję enzymatyczną RNA, ale jest droga (Foregene może zaoferować opłacalne zestawy, więcej szczegółów kliknijTutaj);stosując ekonomiczne i klasyczne metody oczyszczania, takie jak wytrącanie LiCl, można również uzyskać zadowalające wyniki, ale czas działania jest długi..

„Trzy dyscypliny i osiem uwag” do ekstrakcji RNA

Dyscyplina 1:Koniec z zanieczyszczeniem egzogennymi enzymami.

Notatka 1:Ściśle noś maseczki i rękawiczki.

Uwaga 2:Probówki wirówkowe, końcówki, pręty do pipet, zbiorniki do elektroforezy i stoły doświadczalne biorące udział w eksperymencie należy dokładnie zutylizować.

Uwaga 3:Odczynniki/roztwory biorące udział w eksperymencie, zwłaszcza woda, muszą być wolne od RNaz.

Dyscyplina 2:Blokuj aktywność endogennych enzymów

Uwaga 4:Wybierz odpowiednią metodę homogenizacji.

Uwaga 5:Wybierz odpowiedni lizat.

Uwaga 6:Kontroluj początkową ilość próbki.

Dyscyplina 3:Wyjaśnij cel ekstrakcji

Uwaga 7:Gdy jakikolwiek system lizatu zbliża się do maksymalnej początkowej ilości próbki, wskaźnik powodzenia ekstrakcji gwałtownie spada.

Uwaga 8:Jedynym ekonomicznym kryterium udanej ekstrakcji RNA jest sukces w kolejnych eksperymentach, a nie wydajność.

10 najważniejszych źródeł skażenia RNazami

1. Palce są pierwszym źródłem enzymów egzogennych, dlatego należy często nosić i wymieniać rękawiczki.Ponadto należy również nosić maski, ponieważ oddychanie jest również ważnym źródłem enzymów.Dodatkową korzyścią noszenia maski w rękawiczce jest ochrona eksperymentatora.

2. Końcówki do pipet, probówki wirówkowe, pipety – RNazy nie można inaktywować przez samą sterylizację, dlatego końcówki do pipet i probówki wirówkowe powinny być traktowane DEPC, nawet jeśli są oznaczone jako poddane działaniu DEPC.Najlepiej użyć pipety specjalnego przeznaczenia, przed użyciem przetrzeć ją wacikiem nasączonym alkoholem 75%, zwłaszcza końcówkę;ponadto pamiętaj, aby nie używać narzędzia do usuwania głowicy.

3. Woda/bufor muszą być wolne od zanieczyszczeń RNazami.

4. Przynajmniej stół testowy należy przetrzeć do czysta wacikami nasączonymi alkoholem 75%.

5.Endogenna RNaza Wszystkie tkanki zawierają endogenne enzymy, więc szybkie zamrożenie tkanek ciekłym azotem jest najlepszym sposobem na ograniczenie degradacji.Metoda przechowywania/rozdrabniania w ciekłym azocie jest rzeczywiście niewygodna, ale jest to jedyna droga dla tkanek o wysokim poziomie enzymów endogennych.

6. Próbki RNA Produkty do ekstrakcji RNA mogą zawierać śladowe ilości zanieczyszczeń RNazami.

7. Ekstrakcja plazmidu Ekstrakcja plazmidu często wykorzystuje Rnazę do degradacji RNA, a pozostałą Rnazę należy strawić proteinazą K i ekstrahować przez PCI.

8. Przechowywanie RNA Nawet jeśli jest przechowywany w niskiej temperaturze, śladowe ilości RNazy spowodują degradację RNA.Najlepszym rozwiązaniem dla długoterminowej konserwacji RNA jest zawiesina sól/alkohol, ponieważ alkohol hamuje wszelką aktywność enzymatyczną w niskich temperaturach.

9. Jeśli kationy (Ca, Mg) zawierają te jony, ogrzewanie w temperaturze 80°C przez 5 minut spowoduje rozszczepienie RNA, więc jeśli RNA wymaga podgrzania, roztwór konserwujący musi zawierać środek chelatujący (1 mM cytrynian sodu, pH 6,4).

10. Enzymy użyte w kolejnych doświadczeniach mogą być zanieczyszczone RNazą.

10 wskazówek dotyczących ekstrakcji RNA

1: Szybko zapobiegaj aktywności RNazy.Próbki są szybko zamrażane po pobraniu, a RNaza jest inaktywowana przez szybką operację podczas lizy.

2: Wybierz odpowiednią metodę ekstrakcji dla tkanki o wysokiej zawartości rybozymu, a dla tkanki tłuszczowej najlepiej zastosować metodę zawierającą fenol.

3: Jakość predykcji wymaga Northern, konstrukcja biblioteki cDNA wymaga wysokiej integralności, a RT-PCR i RPA (test ochrony przed rybonukleazą) nie wymagają wysokiej integralności.RT-PCR wymaga wysokiej czystości (reszty inhibitora enzymu).

4: Dokładna homogenizacja jest kluczem do poprawy wydajności i zmniejszenia degradacji.

5: Sprawdź integralność wykrywania elektroforezy RNA, 28S: 18S = 2:1 to pełny znak, 1:1 jest również akceptowalny dla większości eksperymentów.

6: Usuwanie DNA do RT-PCR, analiza macierzowa Do usunięcia DNA najlepiej użyć Dnazy I.

7: Zmniejsz zanieczyszczenie egzogennymi enzymami – enzymów nie można importować z zewnątrz.

8: Podczas zatężania kwasu nukleinowego o niskim stężeniu należy dodać odczynnik współstrącający.Ale aby zapobiec współstrącaniu zawierającemu enzymy i zanieczyszczenie DNA.

9: Dokładnie rozpuść RNA, jeśli to konieczne, podgrzej w temperaturze 65°C przez 5 minut.

odpowiedni sposób przechowywania

Może być przechowywany w temperaturze –20C przez krótki czas i w temperaturze –80C przez długi czas.Pierwszym krokiem w poprawie wydajności RNA jest uświadomienie sobie, że zawartość RNA w różnych próbkach jest bardzo zróżnicowana.Wysoka zawartość (2-4 ug/mg), taka jak wątroba, trzustka, serce, średnia obfitość (0,05-2 ug/mg), taka jak mózg, zarodek, nerka, płuca, grasica, jajnik, niska obfitość (<0,05 ug/mg) mg), taka jak pęcherz moczowy, kości, tłuszcz.

1: Zlizuj komórki, aby uwolnić RN – jeśli RNA nie zostanie uwolnione, wydajność zostanie zmniejszona.Homogenizacja elektryczna działa lepiej niż inne metody homogenizacji, ale może również wymagać połączenia z innymi metodami, takimi jak zacieranie ciekłym azotem, trawienie enzymatyczne (Lysozyme/Lyticase)

2: Optymalizacja metody ekstrakcji.Największym problemem metod opartych na fenolu jest niepełna stratyfikacja i częściowa utrata RNA (nie można całkowicie usunąć supernatantu).Niepełne rozwarstwienie jest spowodowane wysoką zawartością kwasów nukleinowych i białek, co można rozwiązać, zwiększając ilość stosowanego lizatu lub zmniejszając ilość próbki.Do tkanki tłuszczowej dodano etap ekstrakcji chloroformem.Utratę RNA można zmniejszyć przez pompowanie wsteczne lub usunięcie warstwy organicznej, a następnie odwirowanie.Największym problemem metod opartych na wirowaniu kolumnowym jest nadmiar próbki.

Klasyczne wskazówki dotyczące ekstrakcji

1. Oczyszczanie fenolem: Dodać równą objętość 1:1 Phenol/Chloroform i energicznie mieszać przez 1-2 minuty.Wirować z dużą prędkością przez 2 minuty.Ostrożnie usunąć supernatant (80-90%).Nigdy nie wchodź do środkowej warstwy.Równą objętość roztworu reakcyjnego można dodać do mieszaniny fenol/chloroform i usunąć supernatant.Dwa supernatanty można mieszać razem w celu wytrącenia kwasu nukleinowego w celu poprawy wydajności.Nie bądź zbyt delikatny podczas mieszania i nie próbuj usunąć całego supernatantu.

2. Płukanie 70-80% etanolem: Podczas płukania kwas nukleinowy musi być zawieszony, aby zapewnić wypłukanie pozostałości soli.Jednocześnie natychmiast po spuszczeniu etanolu wirować na wysokich obrotach przez kilka sekund, a następnie pipetą usunąć pozostały etanol.Rozpuścić po odstaniu w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.

11. Ekstrakcja organizacji specjalnych

1. Tkanka włóknista: kluczem do ekstrakcji RNA z tkanki włóknistej, takiej jak serce/mięśnie szkieletowe, jest całkowite rozerwanie tkanki.Tkanki te mają niską gęstość komórek, więc ilość RNA na jednostkę masy tkanki jest niska i najlepiej jest użyć jak największej ilości wyjściowej.Pamiętaj, aby dokładnie zmielić tkankę w warunkach zamrażania.

2. Tkanki o wysokiej zawartości białka/tłuszczu: zawartość tłuszczu mózgowego/roślinnego jest wysoka.Po ekstrakcji PCI supernatant zawiera białe kłaczki.Supernatant należy ponownie ekstrahować chloroformem.

3. Tkanki o wysokiej zawartości kwasu nukleinowego/rybozymu: śledziona/grasica ma wysoką zawartość kwasu nukleinowego i rybozymu.Rozcieranie tkanki w warunkach zamrażania, a następnie szybka homogenizacja może skutecznie inaktywować rybozymy.Jeśli jednak lizat jest zbyt lepki (ze względu na wysoką zawartość kwasu nukleinowego), ekstrakcja PCI nie będzie w stanie skutecznie rozwarstwiać;dodanie większej ilości lizatu może rozwiązać ten problem.Wielokrotne ekstrakcje PCI mogą usunąć więcej resztkowego DNA.Jeśli natychmiast po dodaniu alkoholu wytrąci się biały osad, oznacza to zanieczyszczenie DNA.Ponowna ekstrakcja za pomocą kwaśnej PCI po rozpuszczeniu może usunąć zanieczyszczenie DNA.

4. Tkanka roślinna: Tkanka roślinna jest bardziej złożona niż tkanka zwierzęca.Ogólnie rzecz biorąc, rośliny są mielone w warunkach ciekłego azotu, więc degradacja RNA przez endogenne enzymy jest rzadkością.Jeśli problem degradacji nie zostanie rozwiązany, prawie na pewno jest to spowodowane zanieczyszczeniami zawartymi w próbce.Zanieczyszczenia zawarte w wielu roślinach prowadzą do pozostałości, a przyczyną pozostałości jest często to, że te zanieczyszczenia mają pewne podobieństwa z RNA: ty wytrącasz i ja wytrącam, i ty adsorbujesz, a ja adsorbuję.Te cechy decydują o tym, że są bardzo silnymi inhibitorami enzymów.

Obecnie komercyjne odczynniki do ekstrakcji RNA można dostosować do prawie wszystkich tkanek zwierzęcych z niewielkimi modyfikacjami, ale istnieje niewiele komercyjnych odczynników do ekstrakcji RNA, które mogą być odpowiednie dla większości tkanek roślinnych.Na szczęście Foregene może zapewnić specjalnezestawy do ekstrakcji roślinnego RNA, mamyZestaw do izolacji całkowitego RNA roślin, Zestaw do izolacji całkowitego RNA roślin Plus.Ten ostatni jest specjalnie zaprojektowany dla roślin o wysokiej zawartości polisacharydów i polifenoli.W przypadku ekstrakcji RNA opinie użytkowników laboratorium są szczególnie dobre.

12. Efekt zamrażania i rozmrażania próbki Zamrożona próbka może być większa i przed użyciem do ekstrakcji RNA należy ją pociąć.Próbki mają tendencję do topienia się (prawdopodobnie częściowo) podczas cięcia.Zamrożone próbki mogą wymagać zważenia przed ekstrakcją RNA, a rozmrożenie na pewno nastąpi podczas tego procesu.Czasami rozmrażanie próbki następuje również podczas procesu mielenia ciekłym azotem;lub zamrożoną próbkę dodaje się bezpośrednio do lizatu bez mielenia ciekłym azotem, a rozmrożenie na pewno nastąpi przed całkowitą homogenizacją.Eksperymenty wykazały, że zamrożona tkanka jest bardziej podatna na degradację RNA podczas rozmrażania niż świeża tkanka.Prawdopodobny powód: proces zamrażania i rozmrażania zakłóca struktury w komórce, ułatwiając endogennym enzymom bezpośredni kontakt z RNA.

13. Ocena jakości RNA Zwykle do oceny integralności RNA stosuje się elektroforezę, a do oceny czystości RNA stosuje się A260/A280.Teoretycznie nienaruszony RNA ma stosunek 28S:18S = 2,7:1, a większość danych podkreśla stosunek 28S:18S = 2:1.Faktem jest, że prawie żaden RNA wyekstrahowany z próbek innych niż komórki nie jest w stosunku 2:1 (uzyskano to za pomocą Agilent Bioanalyzer).

Na wyniki elektroforezy RNA wpływa wiele czynników, w tym struktura drugorzędowa, warunki elektroforezy, obciążenie próbki, stopień nasycenia EB itp. Użyj natywnej elektroforezy do wykrycia RNA i użyj DNA Marker jako kontroli.Jeśli 28S przy 2 kb i 18S przy 0,9 kb są czyste, a 28S: 18S > 1, integralność może spełniać wymagania większości kolejnych eksperymentów.

A260/A280 to wskaźnik, który spowodował wiele zamieszania.Przede wszystkim należy wyjaśnić pierwotne znaczenie tego wskaźnika dla kwasów nukleinowych: czysty RNA, jego A260/280 = około 2,0.Czysty RNA jest „przyczyną”, a A260/A280 = 2 jest „skutkiem”.Teraz wszyscy używają A260/A280 jako „przyczyny”, myśląc, że „jeśli A260/A280 = 2, to RNA jest czyste”, co naturalnie prowadzi do zamieszania.

Jeśli jesteś zainteresowany, możesz dodać trochę odczynnika często używanego do ekstrakcji, takiego jak fenol, izotiocyjanian guanidyny, PEG itp., Do próbki RNA, a następnie zmierzyć stosunek A260/A280.Rzeczywistość jest taka, że ​​wiele odczynników używanych do ekstrakcji RNA, jak również wiele zanieczyszczeń w próbce, absorbuje około A260 i A280, wpływając na A260/A280.

Obecnie najbardziej pouczającym podejściem jest skanowanie próbek RNA w zakresie 200-300 nm.Krzywa czystego RNA ma następujące cechy: krzywa jest gładka, A230 i A260 to dwa punkty przegięcia, A300 jest bliskie 0, A260/A280 = około 2,0, a A260/A230 = około 2,0.Jeśli dane skanu nie są dostępne, należy również określić stosunek A260/A230, ponieważ stosunek ten jest bardziej wrażliwy na przenoszenie wszystkich zanieczyszczeń, które mają wpływ na reakcję enzymatyczną.Weź pod uwagę zakres liniowy urządzenia (0,1–0,5 dla A260).

Istnieją dwa inne przydatne zjawiska: stosunek będzie o około 0,3 niższy, gdy A260/A280 będzie mierzony w wodzie;podczas gdy stosunek zmierzony w 10 mM EDTA jest o około 0,2 wyższy niż ten zmierzony w 1 mM EDTA.

Produkty powiązane:

Producent i dostawca zestawu do całkowitej izolacji RNA w Chinach |Foregene (foreivd.com)

Seria izolacji RNA Dostawcy i fabryka |Producenci serii izolacji RNA w Chinach (foreivd.com)

Seria izolacji RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)