Wyjaśnienie podstawowych terminów biologii molekularnej
1. cDNA i cccDNA: cDNA to dwuniciowy DNA syntetyzowany przez odwrotną transkryptazę z mRNA;cccDNA to plazmidowy dwuniciowy, zamknięty kolisty DNA wolny od chromosomu.
2. Standardowa jednostka fałdowania: drugorzędowa jednostka struktury białka α-helisa i β-arkusz mogą tworzyć bloki strukturalne o specjalnych układach geometrycznych poprzez różne polipeptydy łączące.Ten typ zdeterminowanego fałdowania jest zwykle nazywany strukturą nadrzędną.Prawie wszystkie struktury trzeciorzędowe można opisać tymi typami składania, a nawet ich typami złożonymi, dlatego nazywane są również standardowymi jednostkami składania.
3. CAP: białko receptora cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) CRP (białko receptora cAMP), kompleks powstały po połączeniu cAMP i CRP nazywany jest białkiem aktywującym CAP (białko aktywowane cAMP)
4. Sekwencja palindromowa: Odwrotna komplementarna sekwencja segmentu fragmentu DNA, często miejsce enzymu restrykcyjnego.
5. micRNA: komplementarny interferujący RNA lub antysensowny RNA, który jest komplementarny do sekwencji mRNA i może hamować translację mRNA.
6. Rybozym: RNA o aktywności katalitycznej, który pełni rolę autokatalityczną w procesie składania RNA.
7. Motyw: W strukturze przestrzennej cząsteczek białka występują lokalne regiony o podobnym trójwymiarowym kształcie i topologii
8. Peptyd sygnałowy: peptyd z 15-36 resztami aminokwasowymi na N-końcu podczas syntezy białka, który kieruje transbłoną białka.
9. Atenuator: Sekwencja nukleotydowa między regionem operatora a genem strukturalnym, który kończy transkrypcję.
10. Magiczne miejsce: kiedy bakteria rośnie i napotyka całkowity brak aminokwasów, wywołuje reakcję awaryjną, aby zatrzymać ekspresję wszystkich genów.Sygnałami, które generują tę reakcję awaryjną, są tetrafosforan guanozyny (ppGpp) i pentafosforan guanozyny (pppGpp).Rola PpGpp i pppGpp to nie tylko jeden czy kilka operonów, ale wpływa na dużą ich liczbę, dlatego nazywane są superregulatorami lub magicznymi plamami.
11. Element promotora w górę: odnosi się do sekwencji DNA, która odgrywa rolę regulacyjną w aktywności promotora, takiej jak TATA w regionie -10, TGACA w regionie -35, wzmacniacze i atenuatory.
12. Sonda DNA: znakowany segment DNA o znanej sekwencji, który jest szeroko stosowany do wykrywania nieznanych sekwencji i przeszukiwania docelowych genów.
13. Sekwencja SD: Jest to sekwencja wiążąca rybosom i mRNA, która reguluje translację.
14. Przeciwciało monoklonalne: Przeciwciało, które działa tylko na pojedynczą determinantę antygenową.
15. Kosmid: Jest to sztucznie skonstruowany egzogenny wektor DNA, który zachowuje regiony COS na obu końcach faga i jest połączony z plazmidem.
16. Badanie przesiewowe niebiesko-białej plamki: gen LacZ (kodujący β-galaktozydazę), enzym może rozkładać chromogenny substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolo-β-D-galaktozyd) z wytworzeniem koloru niebieskiego, co powoduje, że szczep jest niebieski.Kiedy wstawia się egzogenny DNA, gen LacZ nie może ulegać ekspresji, a szczep jest biały, tak aby można było badać rekombinowane bakterie.Nazywa się to przesiewaniem niebiesko-białym.
17. Element działający w układzie cis: Specyficzna sekwencja zasad w DNA, która reguluje ekspresję genów.
18. Enzym Klenowa: Duży fragment polimerazy DNA I, z wyjątkiem tego, że aktywność egzonukleazy 5' 3' jest usunięta z holoenzymu polimerazy DNA I
19. Zakotwiczony PCR: używany do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania ze znaną sekwencją na jednym końcu.Ogon poli-dG dodano do jednego końca nieznanej sekwencji, a następnie poli-dC i znaną sekwencję zastosowano jako startery do amplifikacji PCR.
20. Białko fuzyjne: Gen białka eukariotycznego jest połączony z genem egzogennym, a białko złożone z translacji białka oryginalnego genu i białka egzogennego ulega ekspresji w tym samym czasie.
Inne terminy biologii molekularnej
1. Fizyczna mapa DNA to kolejność, w jakiej ułożone są (strawione endonukleazą restrykcyjną) fragmenty cząsteczki DNA.
2. Rozszczepienie RNazy dzieli się na dwa typy (autokataliza) i (heterokataliza).
3. Istnieją trzy czynniki inicjacji u prokariontów: (IF-1), (IF-2) i (IF-3).
4. Białka transbłonowe wymagają przewodnictwa (peptydy sygnałowe), a rolą białek opiekuńczych jest (pomaga złożyć łańcuch peptydowy w natywną konformację białka).
5. Elementy w promotorach można ogólnie podzielić na dwa typy: (elementy promotora podstawowego) i (elementy promotora wyższego rzędu).
6. Treść badań biologii molekularnej obejmuje głównie trzy części: (strukturalna biologia molekularna), (ekspresja i regulacja genów) oraz (technologia rekombinacji DNA).
7. Dwa kluczowe eksperymenty wykazujące, że DNA jest materiałem genetycznym to (zakażenie myszy pneumokokami) i (zakażenie Escherichia coli fagiem T2).potencjał).
8. Istnieją dwie główne różnice między hnRNA i mRNA: (hnRNA ulega splicingowi w procesie przekształcania w mRNA), (koniec 5' mRNA jest dodany z czapeczką m7pGppp, a na końcu 3' kwasowego ogona mRNA (poliA) występuje dodatkowa poliadenylacja).
9. Zaletami wielopodjednostkowej postaci białka są (podjednostka jest ekonomiczną metodą wykorzystania DNA), (może zmniejszyć wpływ przypadkowych błędów w syntezie białka na aktywność białka), (aktywność może być bardzo wydajna i szybko otwiera się i zamyka).
10. Główna treść teorii pierwszego zarodkowania mechanizmu fałdowania białek obejmuje (zarodkowanie), (wzbogacenie strukturalne), (ostateczne przegrupowanie).
11. Galaktoza ma podwójny wpływ na bakterie;z jednej strony (może służyć jako źródło węgla do wzrostu komórek);z drugiej strony (jest również składnikiem ściany komórkowej).Dlatego promotor S2 niezależny od cAMP-CRP jest potrzebny do trwałej syntezy na poziomie tła;jednocześnie do regulacji syntezy na wysokim poziomie potrzebny jest promotor S1 zależny od cAMP-CRP.Transkrypcja zaczyna się od ( S2 ) z G i od ( S1 ) bez G.
12. Technologia rekombinacji DNA jest również znana jako (klonowanie genów) lub (klonowanie molekularne).Ostatecznym celem jest (przeniesienie informacji genetycznej DNA z jednego organizmu do innego organizmu).Typowy eksperyment rekombinacji DNA zwykle obejmuje następujące etapy: (1) Ekstrakcja genu docelowego (lub genu egzogennego) z organizmu dawcy i enzymatyczne połączenie go z inną cząsteczką DNA (wektor do klonowania) w celu utworzenia nowej rekombinowanej cząsteczki DNA.② Zrekombinowana cząsteczka DNA jest przenoszona do komórki biorcy i replikowana w komórce biorcy.Ten proces nazywa się transformacją.③ Przeszukaj i zidentyfikuj te komórki biorców, które wchłonęły rekombinowany DNA.④Wyhoduj komórki zawierające rekombinowane DNA w dużych ilościach, aby wykryć, czy gen pomocy zagranicznej jest eksprymowany.
13. Istnieją dwa typy replikacji plazmidów: te, które są ściśle kontrolowane przez syntezę białek komórki gospodarza nazywane są (plazmidami ścisłymi), a te, które nie są ściśle kontrolowane przez syntezę białek komórki gospodarza nazywane są (plazmidami zrelaksowanymi).
14. System reakcji PCR powinien spełniać następujące warunki:Startery DNA (około 20 zasad) z komplementarnymi sekwencjami na każdym końcu dwóch nici genu docelowego, który ma być rozdzielony.B.Enzymy o stabilności termicznej, takie jak: polimeraza TagDNA.c, dNTPd, sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jako matryca
15. Podstawowy proces reakcji PCR obejmuje trzy etapy: (denaturacja), (wygrzewanie) i (wydłużanie).
16. Podstawowy proces zwierząt transgenicznych zwykle obejmuje: ①Wprowadzenie sklonowanego obcego genu do jądra zapłodnionego jaja lub zarodkowej komórki macierzystej;②Transplantacja zaszczepionej zapłodnionej komórki jajowej lub zarodkowej komórki macierzystej do kobiecej macicy;③Całkowity rozwój embrionalny i wzrost dla potomstwa z obcymi genami;④ Użyj tych zwierząt, które mogą wytwarzać obce białka, jako stada hodowlanego do wyhodowania nowych linii homozygotycznych.
17. Linie komórkowe hybrydoma są generowane przez hybrydyzację komórek (śledziony B) z komórkami (szpiczaka), a ponieważ (komórki śledziony) mogą wykorzystywać hipoksantynę i (komórki kości) zapewniają funkcje podziału komórkowego, można je hodować w pożywce HAT.rosnąć.
18. Wraz z pogłębianiem się badań nazwano pierwszą generację przeciwciał (przeciwciała poliklonalne), drugą generację (przeciwciała monoklonalne) i trzecią generację (przeciwciała inżynierii genetycznej).
19. Obecnie inżynieria genetyczna wirusów owadzich koncentruje się głównie na bakulowirusie, co przejawia się wprowadzeniem (egzogennego genu toksyny);(geny zakłócające normalny cykl życiowy owadów);(modyfikacja genów wirusa).
20. Czynniki białkowe działające w układzie trans odpowiadające wspólnym elementom TATA, GC i CAAT w promotorze ssaczej polimerazy RNA II to odpowiednio (TFIID), (SP-1) i (CTF/NF1).
dwadzieścia jeden.Podstawowymi czynnikami transkrypcyjnymi polimerazy RNA Ⅱ są TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, a ich sekwencja wiążąca to: (D, A, B, E).W którym funkcją TFII-D jest (wiązanie z pudełkiem TATA).
dwadzieścia dwa.Większość czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z DNA, działa w postaci dimerów.Domeny funkcjonalne czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z DNA, są zwykle następujące (helisa-skręt-helisa), (motyw palca cynkowego), motyw suwaka (zasada-leucyna).
dwadzieścia trzy.Istnieją trzy rodzaje trybów cięcia endonukleazą restrykcyjną: (cięcie po stronie 5' osi symetrii w celu wytworzenia lepkich końców 5'), (cięcie po stronie 3' osi symetrii w celu wytworzenia lepkich końców 3' (cięcie po stronie osi symetrii w celu wytworzenia płaskich segmentów)).
dwadzieścia cztery.Plazmidowy DNA ma trzy różne konfiguracje: (konfiguracja SC), (konfiguracja oc), (konfiguracja L).Pierwszym w elektroforezie jest (konfiguracja SC).
25. Egzogenne systemy ekspresji genów, głównie (Escherichia coli), (Drożdże), (Owady) i (tabela komórek ssaków).
26. Powszechnie stosowanymi metodami dla zwierząt transgenicznych są: (metoda infekcji retrowirusowej), (metoda mikroiniekcji DNA), (metoda zarodkowych komórek macierzystych).
Zastosowanie Biologia molekularna
1. Wymień funkcje więcej niż 5 RNA?
Transferowy RNA tRNA Transferowy aminokwas Rybosom RNA rRNA Rybosom stanowi informacyjne RNA mRNA Matryca syntezy białek Heterogeniczny jądrowy RNA hnRNA Prekursor dojrzałego mRNA mały jądrowy RNA snRNA Zaangażowany w splicing hnRNA Mały cytoplazmatyczny RNA scRNA/7SL-RNA Białko zlokalizowane w siateczce osocza i syntetyzowane rozpoznawanie sygnału składniki ciała Antysensowny RNA anRNA/micRNA Reguluje ekspresję genów Rybozym RNA Aktywny enzymatycznie RNA
2. Jaka jest główna różnica między promotorami prokariotycznymi i eukariotycznymi?
Prokariotyczny TTGACA --- TATAAT------Miejsce inicjacji-35 -10 Wzmacniacz eukariotyczny---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Miejsce inicjacji-110 -70 -25
3. Jakie są główne aspekty sztucznej konstrukcji naturalnych plazmidów?
Naturalne plazmidy często mają defekty, więc nie nadają się do wykorzystania jako nośniki w inżynierii genetycznej i muszą być modyfikowane i konstruowane: a.Dodaj odpowiednie geny markerów selekcyjnych, takie jak dwa lub więcej, które są łatwe w użyciu do selekcji, zwykle geny antybiotyków.B.Zwiększ lub zmniejsz odpowiednie miejsca cięcia enzymów, aby ułatwić rekombinację.C.Skróć długość, odetnij zbędne fragmenty, popraw efektywność importu i zwiększ ładowność.D.Zmień replikę, z ciasnej na luźną, z mniejszej liczby kopii na więcej kopii.mi.Dodaj specjalne elementy genetyczne zgodnie ze specjalnymi wymaganiami inżynierii genetycznej
4. Podaj przykład metody różnicowego skriningu tkankowo-swoistego cDNA?
Przygotowuje się dwie populacje komórek, gen docelowy jest eksprymowany lub silnie eksprymowany w jednej z komórek, a docelowy gen nie jest eksprymowany lub jest słabo eksprymowany w drugiej komórce, a następnie gen docelowy jest znajdowany przez hybrydyzację i porównanie.Na przykład, podczas występowania i rozwoju guzów, komórki nowotworowe będą prezentować mRNA z innymi poziomami ekspresji niż normalne komórki.Dlatego geny związane z nowotworem można przeszukiwać przez różnicową hybrydyzację.Metodę indukcji można również zastosować do selekcji genów, których ekspresja jest indukowana.
5. Generowanie i badanie przesiewowe linii komórkowych hybrydoma?
Komórki B śledziony + komórki szpiczaka, dodać glikol polietylenowy (PEG) w celu promowania fuzji komórek, a komórki fuzyjne szpiczaka B śledziony hodowane w pożywce HAT (zawierającej hipoksantynę, aminopterynę, T) nadal rozszerzają się i odżywiają.Fuzja komórkowa zawiera: komórki fuzyjne śledziona-śledziona: niezdolne do wzrostu, komórki śledziony nie mogą być hodowane in vitro.Komórki fuzyjne kości: nie mogą wykorzystywać hipoksantyny, ale mogą syntetyzować purynę drugą drogą przy użyciu reduktazy folianowej.Aminopteryna hamuje reduktazę kwasu foliowego i dlatego nie może rosnąć.Komórki fuzyjne kości i śledziony: mogą rosnąć w HAT, komórki śledziony mogą wykorzystywać hipoksantynę, a komórki kości zapewniają funkcję podziału komórkowego.
6. Jaka jest zasada i metoda określania struktury pierwszorzędowej DNA metodą terminacji dideoksy-końcowej (metoda Sangera)?
Zasadą jest użycie terminatora łańcucha nukleotydowego - 2,3,-dideoksynukleotydu do zakończenia wydłużenia DNA.Ponieważ brakuje mu 3-OH wymaganego do tworzenia wiązań 3/5/fosfodiestrowych, po włączeniu do łańcucha DNA łańcuch DNA nie może być dalej wydłużany.Zgodnie z zasadą parowania zasad, ilekroć polimeraza DNA potrzebuje dNMP do udziału w normalnie rozciągniętym łańcuchu DNA, istnieją dwie możliwości, jedna to udział w ddNTP, co skutkuje zakończeniem wydłużania łańcucha deoksynukleotydowego;drugim jest udział w dNTP , tak aby łańcuch DNA mógł nadal się rozciągać, aż do włączenia następnego ddNTP.Metodą tą można otrzymać grupę fragmentów DNA o różnej długości zakończonych na ddNTP.Metoda polega na podziale na cztery grupy odpowiednio ddAMP, ddGMP, ddCMP i ddTMP.Po reakcji elektroforeza w żelu poliakryloamidowym może odczytać sekwencję DNA zgodnie z pływającymi pasmami.
7. Jaki jest pozytywny wpływ regulacyjny białka aktywatora (CAP) na transkrypcję?
Białko receptora cyklicznego adenylanu (cAMP) CRP (białko receptora cAMP), kompleks utworzony przez połączenie cAMP i CRP nazywa się CAP (białko cAMPaktywowane).Gdy E. coli rośnie w pożywce pozbawionej glukozy, wzrasta synteza CAP, a CAP pełni funkcję promotorów aktywujących, takich jak laktoza (Lac).Niektórym promotorom zależnym od CRP brakuje typowej cechy sekwencji regionu -35 (TTGACA), którą mają wspólne promotory.Dlatego trudno jest związać się z nią polimerazie RNA.Obecność CAP (funkcja): może znacznie poprawić stałą wiązania enzymu i promotora.Pokazuje głównie następujące dwa aspekty: ① CAP pomaga cząsteczce enzymu w prawidłowej orientacji poprzez zmianę konformacji promotora i interakcji z enzymem, tak aby połączyć się z regionem -10 i odgrywać rolę zastąpienia funkcji regionu -35.②CAP może również hamować wiązanie polimerazy RNA z innymi miejscami w DNA, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo wiązania się z jej specyficznym promotorem.
8. Jakie etapy są zwykle zawarte w typowym eksperymencie rekombinacji DNA?
A.Wyodrębnij docelowy gen (lub gen egzogenny) organizmu dawcy i połącz go enzymatycznie z inną cząsteczką DNA (wektor do klonowania), aby utworzyć nową cząsteczkę rekombinowanego DNA.B.Przenieś zrekombinowaną cząsteczkę DNA do komórki biorcy i zreplikuj ją oraz zachowaj w komórce biorcy.Ten proces nazywa się transformacją.C.Przeszukaj i zidentyfikuj te komórki biorców, które wchłonęły rekombinowany DNA.D.Hodować masowo komórki zawierające zrekombinowany DNA w celu wykrycia, czy gen pomocy zagranicznej ulega ekspresji.
9. Konstrukcja biblioteki genowej Podano trzy metody przeszukiwania rekombinantów i krótko opisano ten proces.
Badanie przesiewowe oporności na antybiotyki, inaktywacja oporności przez insercję, badanie przesiewowe plamki niebiesko-białej lub badanie przesiewowe metodą PCR, badanie różnicowe, sonda DNA Większość wektorów do klonowania zawiera geny oporności na antybiotyki (antyampicylina, tetracyklina).Kiedy plazmid zostanie przeniesiony do Escherichia coli, bakterie nabiorą oporności, a te bez przeniesienia nie będą miały oporności.Ale nie może rozróżnić, czy została zreorganizowana, czy nie.W przypadku wektora zawierającego dwa geny oporności, jeśli obcy fragment DNA zostanie wstawiony do jednego z genów i spowoduje inaktywację genu, można zastosować dwie kontrolne płytki zawierające różne leki do przeszukiwania pozytywnych rekombinantów.Na przykład plazmid pUC zawiera gen LacZ (kodujący β-galaktozydazę), który może rozkładać chromogenny substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolo-β-D-galaktozyd) z wytworzeniem błękitu, zmieniając w ten sposób szczep na niebieski.Kiedy wstawiony jest obcy DNA, gen LacZ nie może być eksprymowany, a szczep jest biały, aby przeszukiwać rekombinowane bakterie.
10. Wyjaśnij, na czym polega podstawowy proces pozyskiwania zwierząt transgenicznych z embrionalnych komórek macierzystych?
Embrionalne komórki macierzyste (ES) to komórki embrionalne podczas rozwoju embrionalnego, które można sztucznie hodować i namnażać oraz pełnić funkcję różnicowania się w inne typy komórek.Hodowla komórek ES: Izoluje się i hoduje wewnętrzną masę komórkową blastocysty.Kiedy ES jest hodowany w warstwie wolnej od substancji odżywczych, różnicuje się w różne funkcjonalne komórki, takie jak komórki mięśniowe i komórki N.Podczas hodowli w pożywce zawierającej fibroblasty, ES zachowa funkcję różnicowania.ES można manipulować genetycznie, a jego funkcję różnicowania można zintegrować bez wpływu na jego funkcję różnicowania, co rozwiązuje problem losowej integracji.Wprowadzić egzogenne geny do embrionalnych komórek macierzystych, a następnie wszczepić je do macicy ciężarnych samic myszy, rozwinąć w młode i krzyżować, aby uzyskać myszy homozygotyczne.
