Brak sygnałów wzmocnienia

1. Polimeraza DNA Taq w zestawie traci swoją aktywność z powodu niewłaściwego przechowywania lub upływu terminu ważności zestawu.
Zalecenie: Potwierdź warunki przechowywania zestawu;ponownie dodać odpowiednią ilość Taq DNA Polymerase do systemu PCR lub zakupić nowy zestaw Real Time PCR Kit do powiązanych eksperymentów.

2. W matrycy DNA znajduje się wiele inhibitorów polimerazy DNA Taq.
Sugestia: Ponownie oczyść szablon lub zmniejsz ilość używanego szablonu.

3. Stężenie Mg2+ nie jest odpowiednie.
Zalecenie: Stężenie Mg2+ w 2× Real PCR Mix, które dostarczamy, wynosi 3,5 mM.Jednak w przypadku niektórych specjalnych starterów i matryc stężenie Mg2+ może być wyższe.Dlatego możesz bezpośrednio dodawać MgCl2, aby zoptymalizować stężenie Mg2+.W celu optymalizacji zaleca się za każdym razem zwiększać Mg2+ o 0,5 mM.

4. Warunki amplifikacji PCR nie są odpowiednie, a sekwencja lub stężenie startera jest niewłaściwe.
Sugestia: potwierdzić poprawność sekwencji startera i starter nie uległ degradacji;jeśli sygnał amplifikacji nie jest dobry, spróbuj obniżyć temperaturę hybrydyzacji i odpowiednio dostosuj stężenie startera.

5. Ilość szablonu jest za mała lub za duża.
Zalecenie: Wykonaj rozcieńczenie gradientowe linearyzacji matrycy i wybierz stężenie matrycy dające najlepszy efekt PCR dla eksperymentu Real Time PCR.

NTC ma zbyt wysoką wartość fluorescencji

1. Zanieczyszczenie odczynników spowodowane podczas pracy.
Zalecenie: Wymień odczynniki na nowe do eksperymentów Real Time PCR.

2. Zanieczyszczenie wystąpiło podczas przygotowywania systemu reakcji PCR.
Zalecenia: Podczas pracy należy stosować niezbędne środki ochronne, takie jak: noszenie rękawiczek lateksowych, używanie końcówki do pipety z filtrem itp.

3. Startery ulegają degradacji, a degradacja starterów spowoduje amplifikację niespecyficzną.
Sugestia: Użyj elektroforezy SDS-PAGE, aby wykryć, czy startery są zdegradowane, i zastąp je nowymi starterami do eksperymentów Real Time PCR.

Primer dimer lub amplifikacja niespecyficzna

1. Stężenie Mg2+ nie jest odpowiednie.
Zalecenie: Stężenie Mg2+ w dostarczonym przez nas 2× Real PCR EasyTM Mix wynosi 3,5 mM.Jednak w przypadku niektórych specjalnych starterów i matryc stężenie Mg2+ może być wyższe.Dlatego możesz bezpośrednio dodawać MgCl2, aby zoptymalizować stężenie Mg2+.W celu optymalizacji zaleca się za każdym razem zwiększać Mg2+ o 0,5 mM.

2. Temperatura hybrydyzacji PCR jest zbyt niska.
Sugestia: Za każdym razem zwiększaj temperaturę hybrydyzacji PCR o 1℃ lub 2℃.

3. Produkt PCR jest za długi.
Zalecenie: Długość produktu Real Time PCR powinna wynosić od 100 do 150 pz, nie więcej niż 500 pz.

4. Startery ulegają degradacji, a degradacja starterów doprowadzi do pojawienia się specyficznej amplifikacji.
Sugestia: Użyj elektroforezy SDS-PAGE, aby wykryć, czy startery są zdegradowane, i zastąp je nowymi starterami do eksperymentów Real Time PCR.

5. System PCR jest niewłaściwy lub system jest za mały.
Sugestia: System reakcji PCR jest zbyt mały, co spowoduje zmniejszenie dokładności wykrywania.Do ponownego przeprowadzenia eksperymentu Real Time PCR najlepiej jest użyć systemu reakcji zalecanego przez aparat do ilościowej reakcji PCR.

Słaba powtarzalność wartości ilościowych

1. Instrument działa nieprawidłowo.
Sugestia: Mogą występować błędy między każdym otworem PCR w aparacie, co skutkuje słabą odtwarzalnością podczas zarządzania temperaturą lub wykrywania.Proszę sprawdzić zgodnie z instrukcjami odpowiedniego instrumentu.

2. Czystość próbki nie jest dobra.
Zalecenie: Zanieczyszczone próbki będą prowadzić do słabej powtarzalności eksperymentu, co obejmuje czystość matrycy i starterów.Najlepiej jest ponownie oczyścić matrycę, a startery najlepiej oczyścić metodą SDS-PAGE.

3. Czas przygotowania i przechowywania systemu PCR jest zbyt długi.
Sugestia: Użyj systemu Real Time PCR do eksperymentu PCR natychmiast po przygotowaniu i nie odkładaj go na zbyt długo.

4. Warunki amplifikacji PCR nie są odpowiednie, a sekwencja lub stężenie startera jest niewłaściwe.
Sugestia: potwierdzić poprawność sekwencji startera i starter nie uległ degradacji;jeśli sygnał amplifikacji nie jest dobry, spróbuj obniżyć temperaturę hybrydyzacji i odpowiednio dostosuj stężenie startera.

5. System PCR jest niewłaściwy lub system jest za mały.
Sugestia: System reakcji PCR jest zbyt mały, co spowoduje zmniejszenie dokładności wykrywania.Do ponownego przeprowadzenia eksperymentu Real Time PCR najlepiej jest użyć systemu reakcji zalecanego przez aparat do ilościowej reakcji PCR.