Escherichia Coli O157: Zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego H7 (metoda sondy fluorescencyjnej PCR/liofilizacja)
Opis zestawu:
Nr kat.FP103
Służy do szybkiego wykrywania i badań przesiewowych E. coli O157:H7 w próbkach żywności, paszy, wody i próbek środowiskowych.
Opisy
To jest używane doszybkie wykrywanie i badanie przesiewowe E. coli O157:H7 w próbkach żywności, paszy, wody i próbek środowiskowych.
[Zasada testowania]
Zgodnie z zasadą technologii fluorescencyjnego PCR, specyficzne startery i sondy Taqman są zaprojektowane dla określonego genu Escherichia coli O157: H7 i wykrywane za pomocą instrumentu fluorescencyjnego PCR, aby zrealizować wykrywanie Escherichia coli O157: H7 Jakościowe wykrywanie DNA.
Zawartość zestawu
Uwaga: Sonda kanałowa ROX nie jest dołączona.
| Ckomponenty | Specyfikacja | Qilość |
| Bufor A | Rura | 1 |
| Bufor B | Rura | 1 |
| Kontrola pozytywna | Rura | 1 |
| Negatywna kontrola | Rura | 1 |
Oczekiwane użycie
To jest używane do szybkie wykrywanie i badanie przesiewowe E. coli O157:H7 w próbkach żywności, paszy, wody i próbek środowiskowych.
Warunki przechowywania i data ważności
Przechowywać w temperaturze -20 ℃ w ciemności i unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Okres ważności wynosi 12miesięcy, a data produkcji jest podana na opakowaniu zewnętrznym.
Instrumenty I Materiały Eksploatacyjne
Fluorescencyjny przyrząd do ilościowego PCR, pistolet do pipet i pasujące końcówki, wytrząsarka typu vortex, miniwirówka.
Stosowanie
1. Przetwarzanie próbek
1.1 Typ próbki: Ten zestaw jest odpowiedni do próbek żywności, paszy, wody i innych próbek podejrzanych o skażenie Escherichia coli O157:H7.W przypadku głęboko przetworzonych produktów mięsnych, napojów i innych substancji zawierających pigmenty należy je przepłukać, aby uniknąć wpływu na odbiór sygnału fluorescencji.
1.2 Przetwarzanie próbki: Patrz „GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test” w celu przygotowania próbki, wzbogacania hodowli i izolacji Escherichia coli O157: H7.
- NEkstrakcja kwasu nukleinowego
Wziąć 20 ml roztworu wzbogacającego do 1,5 ml probówki wirówkowej, dodać 200 μl lizatu drobnoustrojów (wymagany jest dodatkowy zestaw), worteksować przez 30 sekund, krótko odwirować i odstawić.
Uwagi: Ekstrakcja kwasu nukleinowego z lizatu powinna zakończyć się w ciągu 10 minut i nie może być przechowywana przez dłuższy czas.
3. Amplifikacja kwasu nukleinowego
3.1 Włącz aparat do fluorescencyjnej ilościowej reakcji PCR.
Buffer A i Buffer B z zestawu , rozpuść je dokładnie i krótko odwiruj.Dodać 18 μl buforu A i 2 μl buforu B do każdej probówki do reakcji PCR.Następnie dodaj po 5 ml kontroli negatywnej, wyekstrahowanego kwasu nukleinowego i kontroli pozytywnej do probówek do reakcji PCR, zakorkuj probówki i krótko wiruj.
3.3 Przenieś probówkę do reakcji PCR do urządzenia do fluorescencyjnej reakcji PCR i wykonaj następujące procedury w celu przeprowadzenia eksperymentów z amplifikacją: wybierz 25 mL dla układu reakcyjnego, zbierz sygnały fluorescencyjne w temperaturze 60°C dla każdego cyklu i wybierz FAM dla kanału detekcji.
| Krok | Program | Liczba cykli |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60 ℃ 30s (zbierz fluorescencję) |
Przewodniki do analizy problemów
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Nie można wyekstrahować żadnego RNA lub wydajność kwasu nukleinowego jest niska
Zwykle istnieje wiele czynników, które wpływają na skuteczność odzyskiwania, takich jak: zawartość RNA w próbce, metoda działania, objętość elucji itp..
Analiza typowych przyczyn:
1. Kąpiel lodowa lub wirowanie w niskiej temperaturze (4°C) podczas pracy.
Sugestia: praca w temperaturze pokojowej (15-25°C), nigdy kąpiel lodowa i wirówka niskotemperaturowa.
2. Niewłaściwe przechowywanie próbek lub zbyt długie przechowywanie próbek.
Sugestia: Przechowuj próbki w temperaturze -80 ° C lub zamrażaj w ciekłym azocie i unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania;spróbuj użyć świeżo pobranych próbek do ekstrakcji RNA.
3. Niewystarczająca liza próbki
Zalecenie: Należy upewnić się, że próbka i roztwór roboczy (Linear Acrylamide) zostały dokładnie wymieszane i inkubowane przez 10 min w temperaturze pokojowej (15-25°C)
4. Eluent został dodany nieprawidłowo
Zalecenie: Upewnij się, że ddH2O wolna od RNaz została dodana na środek membrany kolumny oczyszczającej
5. Niewłaściwa ilość bezwodnego etanolu w buforze Buffer viRW2
Sugestia: Postępuj zgodnie z instrukcjami, dodaj odpowiednią objętość bezwodnego etanolu do Buffer viRW2 i dobrze wymieszaj przed użyciem zestawu.
6. Niewłaściwe użycie próbki.
Sugestia: 200 µl próbki na 500 µl Buffer viRL.Nadmierna objętość próbki spowoduje zmniejszenie szybkości ekstrakcji RNA.
7. Niewłaściwa objętość elucji lub niepełna elucja.
Sugestia: Objętość eluentu kolumny oczyszczającej wynosi 30-50 μl;jeśli efekt elucji nie jest zadowalający, zaleca się dodanie podgrzanego ddH wolnego od RNaz2O i wydłużyć czas umieszczania w temperaturze pokojowej, np. 5-10 min
8. Kolumna oczyszczająca zawiera pozostałości etanolu po przepłukaniu w Buffer viRW2.
Sugestia: Jeśli po przepłukaniu w Buffer viRW2 i pustym wirowaniu przez 2 minuty nadal pozostaje etanol, kolumnę oczyszczającą można pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut po odwirowaniu w pustej probówce, aby całkowicie usunąć pozostały etanol.
Degradacja oczyszczonych cząsteczek RNA
Jakość oczyszczonego RNA jest związana z takimi czynnikami jak przechowywanie próbki, zanieczyszczenie RNazą i działanie.
Analiza typowych przyczyn:
1. Pobrane próbki nie zostały zapisane na czas.
Sugestia: Jeśli próbka nie zostanie wykorzystana w czasie po pobraniu, należy ją natychmiast przechowywać w temperaturze -80 ℃ lub w ciekłym azocie.Do ekstrakcji cząsteczek RNA staraj się używać świeżo pobranych próbek, gdy tylko jest to możliwe.
2. Pobrane próbki wielokrotnie zamrażano i rozmrażano.
Sugestia: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania (nie więcej niż jeden raz) podczas pobierania i przechowywania próbek, w przeciwnym razie wydajność kwasu nukleinowego spadnie.
3. Na sali operacyjnej wprowadzono RNazę lub nie założono rękawiczek jednorazowych, maseczek itp.
Sugestia: Eksperyment z ekstrakcją cząsteczek RNA najlepiej przeprowadzać w oddzielnym pomieszczeniu operacyjnym RNA, a stół doświadczalny jest czyszczony przed eksperymentem.Podczas eksperymentu należy nosić jednorazowe rękawiczki i maski, aby uniknąć degradacji RNA spowodowanej wprowadzeniem RNazy.
4. Odczynnik jest zanieczyszczony RNazą podczas użytkowania.
Sugestia: Wymień na nowy zestaw do izolacji wirusowego RNA dla powiązanych eksperymentów.
5. Zanieczyszczenie RNazami probówek wirówkowych, końcówek pipet itp. Sugestia: Upewnij się, że probówki wirówkowe, końcówki pipet i pipety są wolne od RNaz.
Oczyszczone cząsteczki RNA wpłynęły na późniejsze eksperymenty
Cząsteczki RNA oczyszczone przez kolumnę oczyszczającą wpłyną na dalsze eksperymenty, jeśli będzie zbyt dużo jonów soli lub białek, takich jak: odwrotna transkrypcja, Northern Blot itp..
1. W eluowanych cząsteczkach RNA znajdują się pozostałe jony soli.
Zalecenie: Upewnij się, że do buforu Buffer viRW2 dodano odpowiednią objętość bezwodnego etanolu i dwukrotnie przemyj kolumnę oczyszczającą zgodnie z prawidłową prędkością wirowania podaną w instrukcji obsługi. Jeśli nadal pozostają jony soli, możesz dodać bufor viRW2 do kolumny oczyszczającej i pozostawić ją w temperaturze pokojowej na 5 minut.Następnie wykonaj wirowanie, aby w jak największym stopniu usunąć zanieczyszczenia jonami soli
2. W eluowanych cząsteczkach RNA znajduje się pozostały etanol
Sugestia: po potwierdzeniu, że kolumny oczyszczające zostały przepłukane Buffer viRW2, należy wykonać wirowanie w pustej probówce zgodnie z prędkością wirowania podaną w instrukcji obsługi.Jeśli nadal pozostaje etanol, można go pozostawić na 5 minut w temperaturze pokojowej po odwirowaniu z pustą probówką, aby w największym stopniu usunąć pozostały etanol.
Podręczniki:
Instrukcja obsługi zestawu do izolacji wirusowego RNA
