Byliśmy doświadczonym producentem.Zdobycie większości w kluczowych certyfikatach na swoim rynku dla dużych dyskontowych chińskich sond jednostopniowych o wysokiej czułości Rt-QpcrKit V2, Jakość to życie fabryczne, Skupienie się na zapotrzebowaniu klienta jest źródłem przetrwania i rozwoju firmy, Przestrzegamy uczciwości i postawy pracy w dobrej wierze, czekamy na Twoje przybycie!
Byliśmy doświadczonym producentem.Zdobycie większości w kluczowych certyfikatach swojego rynku dlaChina Taq Polimeraza DNA, Qpcr, Nasza firma obiecuje: rozsądne ceny, krótki czas produkcji i satysfakcjonującą obsługę posprzedażową, zapraszamy również do odwiedzenia naszej fabryki w dowolnym momencie.Szkoda, że ​​nie mamy razem przyjemnych i długoterminowych interesów!!!

Opisy

Ten zestaw wykorzystuje unikalny system buforów do lizy, który może szybko uwalniać RNA z próbek hodowanych komórek do reakcji RT-qPCR, eliminując w ten sposób czasochłonny i pracochłonny proces oczyszczania RNA.Matrycę RNA można uzyskać w zaledwie 7 minut.Odczynniki 5×Direct RT Mix i 2×Direct qPCR Mix-SYBR zawarte w zestawie mogą szybko i skutecznie uzyskiwać ilościowe wyniki PCR w czasie rzeczywistym.

5×Direct RT Mix i 2×Direct qPCR Mix-SYBR mają silną tolerancję na inhibitory, a lizat próbek może być użyty bezpośrednio jako matryca do RT-qPCR.Ten zestaw zawiera unikalną odwrotną transkryptazę Foregene o wysokim powinowactwie do RNA i polimerazę DNA Hot D-Taq, dNTP, MgCl2₂, bufor reakcyjny, optymalizator PCR i stabilizator.

Specyfikacje

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Elementy zestawu

Funkcje i zalety

■ Prosty i skuteczny: dzięki technologii Cell Direct RT próbki RNA można pobrać w zaledwie 7 minut.

■ Zapotrzebowanie na próbki jest niewielkie, można przetestować zaledwie 10 komórek.

■ Wysoka przepustowość: może szybko wykrywać RNA w komórkach hodowanych na 384, 96, 24, 12, 6-dołkowych płytkach.

■ DNA Eraser może szybko usunąć uwolnione genomy, znacznie zmniejszając wpływ na późniejsze wyniki eksperymentów.

■ Zoptymalizowany system RT i qPCR sprawia, że ​​dwuetapowa odwrotna transkrypcja RT-PCR jest bardziej wydajna, a PCR bardziej specyficzny i bardziej odporny na inhibitory reakcji RT-qPCR.

Aplikacja zestawu

Zakres zastosowania: hodowane komórki.

- RNA uwolniony w wyniku lizy próbki: dotyczy tylko matrycy RT-qPCR tego zestawu.

- Zestaw może być używany do następujących celów: analiza ekspresji genów, weryfikacja efektu wyciszania genów za pośrednictwem siRNA, skrining leków itp.

Diagram

Przechowywanie i trwałość

Część I tego zestawu należy przechowywać w temperaturze 4℃;Część II należy przechowywać w temperaturze -20℃.

Foregene Protease Plus II należy przechowywać w temperaturze 4 ℃, nie zamrażać w temperaturze -20 ℃.

Odczynnik 2×Direct qPCR Mix-SYBR należy przechowywać w temperaturze -20℃ w ciemności;jeśli jest często używany, może być również przechowywany w temperaturze 4 ℃ do krótkotrwałego przechowywania (zużycie w ciągu 10 dni). Jesteśmy doświadczonym producentem.Zdobycie większości w kluczowych certyfikatach swojego rynku dla dużych rabatów w Chinach Jednostopniowa sonda Rt-Qpcr Kit V2 o wysokiej czułości, Jakość to żywotność fabryczna, Skupienie się na zapotrzebowaniu klienta jest źródłem przetrwania i rozwoju firmy, Przestrzegamy uczciwości i postawy pracy w dobrej wierze, czekamy na Twoje przybycie!
Duże zniżkiChina Taq Polimeraza DNA, Qpcr, Nasza firma obiecuje: rozsądne ceny, krótki czas produkcji i satysfakcjonującą obsługę posprzedażną, zapraszamy również do odwiedzenia naszej fabryki w dowolnym momencie.Szkoda, że ​​nie mamy razem przyjemnych i długoterminowych interesów!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Takman

Nr kat. DRT-01021/01022

Do bezpośredniego RT-qPCR na komórkach przy użyciu ≤ 1000 000 komórek

Wprowadzenie produktów

Ten produkt wykorzystuje unikalny system buforów do lizy, aby szybko uwolnić RNA z próbek hodowanych komórek do reakcji RT-qPCR, eliminując czasochłonny i pracochłonny proces oczyszczania RNA, a tylko 7 minut, aby uzyskać wymaganą matrycę RNA, z 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman dostarczonymi w zestawie, można szybko i skutecznie uzyskać ilościowe wyniki PCR w czasie rzeczywistym.

5× Direct RT Mix i 2× Direct qPCR Mix-Taqman mają silną tolerancję na inhibitory i mogą przeprowadzać skuteczne odwrócenie i specyficzną amplifikację przy użyciu lizatu badanej próbki jako matrycy.Odczynnik zawiera Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, który może być używany z buforem do lizy w celu szybkiego i łatwego wykrywania próbek i charakteryzuje się wysoką czułością, specyficznością i stabilnością.

Cechy produktu

Prosta, skuteczna technologia Cell Direct RT, dzięki której pobranie próbek RNA zajmuje zaledwie 7 minut.

Wymagania dotyczące próbek są niewielkie, a do eksperymentów można użyć co najmniej 10 hodowanych komórek.

Wysoka przepustowość do szybkiego pozyskiwania RNA z hodowanych komórek, takich jak płytki 384, 96, 24, 12 i 6-dołkowe.

DNA Eraser jest w stanie szybko usunąć uwolnione genomy, znacznie zmniejszając wpływ na późniejsze wyniki eksperymentów.

Zoptymalizowane systemy RT i qPCR umożliwiają dwuetapowy RT-PCR z wydajniejszą odwrotną transkrypcją, specyficznością i silniejszą tolerancją inhibitora reakcji RT-qPCR.

Aplikacja zestawu

Zakres zastosowania: Hodowane komórki.

RNA zinterpretowane w wyniku lizy próbki: używane wyłącznie jako dwuetapowa matryca RT-qPCR.

Zestawy mogą być używane do następujących celów: analiza ekspresji regulatorowej genów, testowanie alleli, skrining leków itp.

Ograniczenia zestawu

Amplifikowane fragmenty ≤ 300 bp.

Zestawy służą do świeżej hodowli komórek.

Kontrola jakości produktów

Zgodnie z całościowym systemem zarządzania jakością FOREGENE, każda partia zestawów z serii Cell Direct RT-qPCR jest wielokrotnie rygorystycznie testowana, aby zapewnić niezawodność i stabilność jakości każdej partii zestawów.

Zawartość zestawu

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman można zakupić oddzielnie, szczegóły w Załączniku 1 (STRONA 13).

Warunki przechowywania

1. Warunki wysyłki

Cały proces transportu pojemnika z lodem w niskich temperaturach, aby upewnić się, że zestaw jest w stanie <4 ° C.

2. Warunki przechowywania

Część I przechowywać w temperaturze 4°C, część II w temperaturze -20°C.

Foregene Protease Plus II należy przechowywać w temperaturze 4°C, nie zamrażać w temperaturze -20°C.

Odczynnik 2× Direct qPCR Mix-Taqman przechowuje się w temperaturze -20°C lub w temperaturze 4°C do krótkotrwałego użytku, jeśli jest często używany (w ciągu 10 dni).

Informacje o składnikach zestawu

Bufor CL: Zapewnia środowisko wymagane do reakcji lizy komórek.

Bufor ST: zatrzymuje substancję czynną w lizacie, aby uniknąć wpływu na późniejszą RT.

DNA Eraser: narzędzie do usuwania DNA, efekt usunięcia genomu w kolejnych eksperymentach.

5× Direct RT Mix: Zawiera odwrotną transkryptazę Foregene o wysokim powinowactwie RNA, inhibitor RNazy, dNTP, stabilizatory, wzmacniacze, optymalizatory i startery do odwrotnej transkrypcji dla optymalnego dopasowania (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Elementarz).

Foregene Protease Plus II: W kontekście buforu do lizy komórki są lizowane w celu uwolnienia kwasów nukleinowych.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Ten odczynnik zawiera gorącą polimerazę DNA D-Taq, dNTP, MgCl2₂, bufor reakcyjny, optymalizator PCR i stabilizator.

20× ROX Reference Dye: Zwykle używany w urządzeniach do amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym firm ABI, Stratagene i innych, służy do wyrównania różnicy między probówkami PCR i probówkami spowodowanymi błędami dawkowania PCR.Stężenie barwnika referencyjnego 20x ROX wymagane dla różnych instrumentów jest różne, a użytkownik może je dodać zgodnie z zalecanym stężeniem instrumentu.

ddH wolne od RNaz₂O: Wolna od RNaz sterylizowana, ultraczysta woda do dwuetapowych reakcji RT-qPCR.

Środki ostrożności:(Przed użyciem zestawu należy uważnie przeczytać środki ostrożności)

Zwróć uwagę na metodę działania eksperymentu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami.

Zwróć uwagę na czystość środowiska eksperymentalnego i narzędzi, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazami i degradacji RNA.

Pobieraj świeże lub dobrze zakonserwowane próbki komórek i nigdy nie używaj powtarzających się próbek komórek zamrożonych i rozmrożonych.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman powinien unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, w przeciwnym razie wpłynie to na odwrotną transkrypcję i wydajność PCR.

Przygotujracje żywnościowezanimoperacja

Przed użyciem tego zestawu należy uważnie przeczytać instrukcje.Zestaw Cell Direct RT-qPCR Kit jest prosty, wygodny i szybki w obsłudze, a instrukcje dostarczają pełnych informacji o całym zestawie i sposobie jego prawidłowego używania.Proszę przygotować niezbędne materiały eksperymentalne i sprzęt przed użyciem.

Materiały i sprzęt doświadczalny

◆ Hodowla komórek.

◆ 1,5 ml lub 2 ml probówka wirówkowa wolna od RNaz/DNaz, końcówka wolna od RNaz/DNaz, sterylna probówka qPCR 0,2 ml.

◆ maszyna qPCR, pipeta, wirówka stołowa (≥13 400×g) (w zależności od potrzeb eksperymentalnych) itp.

Bezpieczeństwo

◆ Ten produkt służy wyłącznie do celów badań naukowych, proszę nie używać go do celów farmaceutycznych, klinicznych, spożywczych i kosmetycznych.

◆ Podczas stosowania środków chemicznych należy nosić odpowiednią odzież laboratoryjną, rękawice, okulary ochronne itp.

Operacjaprzewodniki

Systemy Cell Lysis, systemy RT i pakiety uzupełniające roztworu reakcyjnego qPCR można zakupić oddzielnie, szczegółowe informacje zawiera Dodatek 1 (STRONA 13).

Przewodnik po operacjach

O: Uwalnianie próbki RNA

1. Komórki poddano wstępnej obróbce: Płytkę do hodowli komórkowej przemyto zimnym PBS, a następnie poddano lizie komórki (10-10⁶), 10⁶ niż ilość komórek, zaleca się Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) lub Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) do ekstrakcji i oczyszczania RNA.

1.1.Komórki przylegające (płytka 24-dołkowa jako przykład)

1.1.1.Określ liczbę komórek w każdym dołku, ustal, że liczba komórek wynosi 1 × 10⁵i za pomocą pipety usuń pożywkę z szalki hodowlanej.

1.1.2.Dodać 200 μl wstępnie schłodzonego 1 × PBS do każdego dołka.Nie pipetuj wielokrotnie i usuwaj PBS z dołków.Przechyl płytkę i usuń jak najwięcej PBS.Przejdź do kroku 2.

1.1.3.W szalce do hodowli komórkowej dodano inną szalkę do hodowli komórkowej lub numer referencyjny tabeli 1-1 w szalce do hodowli komórkowej wstępnie schłodzonej 1 x PBS w celu przemycia komórek.

Tabela 1-1: Dawkowanie PBS dla różnej liczby komórek

Notatka：Aby zapewnić mocne przyleganie komórek，unika się dużej liczby utraty komórek podczas prania.

1.2.Komórki zawiesinowe lub komórki adherentne hodowane na nieporowatych płytkach

1.2.1.Przylegające komórki hoduje się na płytkach innych niż wielodołkowe (zawiesinę komórek rozpoczyna się od następnego etapu 1.2.2), zbiera się i rozdziela komórki zgodnie z normalną metodą pobierania komórek, a następnie umieszcza się je na płytce hodowlanej lub w probówce do wirowania;jeśli stosuje się trypsynizację, wymagają odwirowania w celu zebrania komórek i usunięcia resztek trypsyny, do poszczególnych komórek dodano ponownie zawieszone komórki w PBS w celu rozproszenia komórek.

1.2.2.Po zliczeniu liczby komórek komórki podzielono na porcje 1 x 10⁵ jeden do odwirowania probówek, zebrać komórki przez wirowanie przy 1000 x g przez 10 min.

1.2.3.Dodaj 200 μl PBS do probówki wirówkowej, nie pipetuj wielokrotnie i bezpośrednio zaaspiruj PBS.przejść do etapu 2. (Jeśli wytrącenie było trudne, a komórki ponownie zawieszono, można wykonać odwirowanie 1000 x g 10 min po odrzuceniu supernatantu, osad komórek przejść do etapu 2)

2.Liza komórek: Usunąć Buffer CL, jego temperaturę doprowadzono do temperatury pokojowej, DNA Eraser i Foregene Protease Plus II, zgodnie z poniższą tabelą 1-2 przygotowany system lizy: (roztwór do lizy jest gotowy do użycia).

Tabela 1-2: dekolt przygotowanie systemu (Uwaga: w przygotowaniu na lodzie)

3. (płytka 24-dołkowa jako przykład) Odpipetować 200 μl mieszaniny do lizy komórek do każdego dołka, kilkakrotnie przedmuchać 5-10 razy, inkubować w temperaturze pokojowej (20-25 ℃) przez 5 min.

Notatka：Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, podczas pipetowania należy ustawić skalę pipety na 200 μl lub mniej.Komórki mogą wydawać się mętne po lizie, co jest normalne.

4. (płytka 24-studzienkowa jako przykład) dodaje się do cieczy 20 μl Buffer ST (różne systemy lizy Buffer ST dodaje się w ilości pokazanej w Tabeli 1-3), powtarzane pipetowanie 5-10 razy, w temperaturze pokojowej (20-25 ℃ ) inkubowano przez 2 min.

Notatka：Końcówkę pipety umieścić pod powierzchnią, upewniając się, że lizat został dodany，aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, podczas pipetowania skala pipety została ustawiona na 200 μl lub mniej.

Tabela 1-3：Dodaj bufor ST

5. Lizat jest używany do kolejnych eksperymentów RT-qPCR.Jeśli kolejne eksperymenty nie mogą być przeprowadzone na czas, trzymaj go w lodzie nie dłużej niż 2 godziny i przechowuj w temperaturze -20 ℃ lub -80 ℃ (nie dłużej niż trzy miesiące).

B: Przygotowanie systemu RT

1. Wyjmij 5 × Direct RT Mix i umieść go w łaźni lodowej, pozwól mu naturalnie się stopić i delikatnie wymieszaj do późniejszego użycia;wyjmij wolną od RNazy ddH2O i rozpuść ją i umieść w łaźni lodowej do późniejszego użycia.Przygotuj układ reakcyjny na lodzie zgodnie z Tabelą 2-1 poniżej.

Tabela 2-1: Przygotowanie układu reakcyjnego RT

2. Po zakończeniu formułowania układu delikatnie wymieszać i krótko odwirować w poniższej tabeli 2 - 2 warunki reakcji Reakcja RT.

Tabela 2-2: Ustawienie warunków reakcji RT

3. Po zakończeniu reakcji produkt reakcji umieszczono bezpośrednio na lodzie do qPCR , należy zachować długoterminową konserwację -20 ℃ lub -80 ℃ .

Uwaga: Ze względu na użycie nieoczyszczonej matrycy w produkcie odwrotnej transkrypcji mogą pojawić się białe osady.Jest to normalne zjawisko.Natychmiast odwirować supernatant do kolejnych doświadczeń.

Otrzymany roztwór reakcyjny RT dodaje się do systemów reakcji Real Time PCR następnego etapu, zaleca się dodanie ilości w zakresie od 10-30% układu reakcyjnego.

C: przygotowanie systemu reakcji qPCR

1. Odpowiednia ilość B przygotowana w etapie matrycy cDNA zgodnie z poniższą tabelą 3-1 w celu przygotowania układu reakcyjnego.

Uwaga: Ilość szablonu cDNA stanowi 10-30% systemu qPCR.Na przykład w systemie qPCR 20 μl dodać 2-6 μl buforu do lizy, ale nie więcej niż 6 μl.

2.Optymalizacja dobrych warunków qPCR (temperatura hybrydyzacji itp.) dla reakcji qPCR (warunki reakcji podano w tabeli 3-2).

Uwaga: Spróbuj użyć zoptymalizowanych warunków dla reakcji qPCR, aby uzyskać lepsze wyniki.

Tabela 3-1: Przygotowanie systemu reakcji PCR

1*: Stężenie startera można regulować w zakresie 50-900 nM, gdy wydajność reakcji startera jest słaba.

Uwaga: System qPCR można dostosować do potrzeb eksperymentalnych i modelu cyklera fluorescencyjnego.Do qPCR w 50μl systemu, dostosuj dawkę odczynnika proporcjonalnie do 20μl system.

2*: Wybierz odpowiednie stężenie końcowe barwnika referencyjnego ROX zgodnie z ilościowym termocyklerem fluorescencyjnym.Najbardziej odpowiednie stężenia barwnika referencyjnego ROX dla typowych ilościowych cyklerów fluorescencyjnych przedstawiono w poniższej tabeli:

Tabela 3-2: Przedstawiono warunki reakcji qPCR

Uwaga: Aby uzyskać najlepszy efekt qPCR, można zastosować gradient PCR w celu optymalizacji warunków reakcji dla różnych matryc i różnych starterów.Warunki reakcji PCR różnią się w zależności od analizatora fluorescencyjnego, matrycy, startera itp. W przypadku konkretnej operacji optymalne warunki reakcji należy zaprojektować zgodnie z określonymi warunkami fluorescencyjnego termocyklera ilościowego, typem matrycy, rozmiarem interesującego fragmentu, sekwencją zasad amplifikowanego fragmentu oraz zawartością GC i długością starterów, w tym temperaturą przyłączania, czasem reakcji itp.

Zasady projektowania starterów do PCR w czasie rzeczywistym

Podkład do przodu i Podkład do tyłu

W przypadku PCR w czasie rzeczywistym projekt startera jest bardzo ważny.Startery są związane ze specyficznością i wydajnością amplifikacji PCR i mogą być zaprojektowane w odniesieniu do następujących zasad:

◆ Długość startera: 18-30 pz.

◆ Zawartość GC: 40-60%.

◆ Wartość Tm: Oprogramowanie do projektowania podkładów, takie jak Primer 5, może podać wartość Tm podkładu.Wartości Tm starterów w górę iw dół powinny być jak najbardziej zbliżone.Można również zastosować wzór obliczeniowy Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Podczas przeprowadzania PCR jako temperaturę przyłączania zazwyczaj wybiera się temperaturę poniżej wartości Tm startera wynoszącej 5°C (odpowiedni wzrost temperatury przyłączania może zwiększyć specyficzność reakcji PCR).

◆ Startery i produkty PCR:

◆ Długość produktu amplifikacji PCR startera projektowego wynosi korzystnie 100-150 bp.

◆ W miarę możliwości należy unikać podkładów projektowych w drugorzędowym obszarze strukturalnym szablonu.

◆ Należy unikać tworzenia 2 lub więcej komplementarnych zasad między końcami 3' starterów w górę iw dół.

◆ Podstawa końcowa 3′ podkładu nie może być obecna z 3 dodatkowymi kolejnymi G lub C.

◆ Same startery nie mogą mieć komplementarnych struktur, w przeciwnym razie powstanie struktura szpilki do włosów, wpływająca na amplifikację PCR.

◆ ATCG powinien być rozłożony możliwie równomiernie w sekwencji startera i należy unikać 3'-końcowej zasady, ponieważ T.

Załącznik1：Cell DirectRT-qPCR Element zestawupakiet suplementów

1. Roztwór do lizy komórek