RT-qPCR to podstawowy eksperyment biologii molekularnej i każdy musi go znać.Obejmuje głównie trzy etapy: ekstrakcję RNA, odwrotną transkrypcję do cDNA i fluorescencyjną ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym.Nie pomaga, co się dzieje?Jest prawdopodobne, że jest problem zeksperyment odwrotnej transkrypcji!Chociaż wydaje się, że eksperyment z odwrotną transkrypcją wymaga jedynie dodania RNA, dNTP, starterów iodwrotna transkryptazado probówki wirówkowej i dobrze wymieszać, ale w rzeczywistym procesie operacyjnym nadal istnieje wiele szczegółów, na które należy zwrócić uwagę.Dowiedzmy się o tym!

Jak ocenić jakość RNA?
Aby uzyskać cDNA, jakość RNA ma kluczowe znaczenie!Jakość RNA można wykryć głównie na podstawie dwóch aspektów:
(1) Integralność RNA:Integralność RNA można zweryfikować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Biorąc za przykład eukarionty, całkowity całkowity RNA ma trzy wyraźne prążki, masy cząsteczkowe od dużych do małych to 28S, 18S i 5S, a 28S jest dwa razy jaśniejszy niż 18S;jeśli widoczne są trzy prążki, ale rodzaj prążków jest niewyraźny lub dyfuzja oznacza, że ​​RNA jest częściowo zdegradowane.W tym momencie prosimy o natychmiastowe wykonanie reakcji odwrotnej transkrypcji i odpowiednie zwiększenie wkładu szablonu;jeśli widać tylko prążek o małej masie cząsteczkowej lub nie widać prążka, oznacza to, że RNA został całkowicie zdegradowany i należy go ponownie wyekstrahować.Agilent 2100 wskazuje integralność RNA za pomocą wykresu pików i wartości RIN.Jeśli kwas nukleinowy jest nienaruszony, linia podstawowa elektroforogramu jest płaska;jeśli kwas nukleinowy jest poważnie zdegradowany, linia podstawowa jest nierówna i pojawia się więcej pików degradacji;wartość RIN odzwierciedla integralność RNA, w zakresie 0-10, im większa wartość, tym lepsza jakość RNA.Cóż, im wyższy stopień kompletności.
(2) Czystość RNA:Stosunek OD260/280 można wykryć za pomocą spektrofotometrii UV.Jeśli stosunek OD260/280 wynosi od 1,9 do 2,1, czystość jest bardzo dobra.
Pozostałości genomowego DNA mogą prowadzić do niedokładnych wyników ilościowych
Po ekstrakcji RNA otrzymany RNA może zostać zmieszany z genomowym DNA (gDNA), który nie został oczyszczony.Dlatego cDNA po odwrotnej transkrypcji również zostanie zmieszanegDNA.Podczas dolnego bieguqPCRreakcja,cDNAi gDNA mogą być amplifikowane jednocześnie, co skutkuje stosunkowo małą wartością CT, więc wyniki mogą być zafałszowane.
Co więc powinniśmy zrobić w tej sytuacji?Foregenewskazuje:
(1) Wykonaj czyszczenie genomu na odwróconym RNA, który można usunąć za pomocą ekstrakcji kolumnowej podczas ekstrakcji RNA;
(2) Traktuj wyekstrahowany RNA DNaząI , ale zakończ go EDTA;
odczynników do odwrotnej transkrypcjiz modułami oczyszczania genomu;

Jak wybrać startery do odwrotnej transkrypcji?
Startery do odwrotnej transkrypcji wpływają również na wynik reakcji odwrotnej transkrypcji.Możesz wybrać startery losowe, Oligo dT lub startery specyficzne dla genu do odwrotnej transkrypcji w zależności od konkretnych okoliczności eksperymentu:
(1) Konkretne transkrypcje: zalecane są startery specyficzne dla genu;
(2) Transkrypty długich fragmentów: zalecane są startery oligo dT/specyficzne dla genu;
(3) Wewnętrzne fragmenty transkryptów długosegmentowych: startery specyficzne dla genu / startery losowe / startery losowe + Oligo dT.Jeśli przeprowadzany jest późniejszy eksperyment qPCR, Oligo dT nie może być użyte samodzielnie, ponieważ użycie samego Oligo dT może spowodować odchylenie końca 3', co prowadzi do niedokładnych wyników eksperymentu qPCR;
(4) miRNA: Można zastosować startery z pętlą łodygi lub startery ogonowe.

Ile razy należy rozcieńczyć cDNA produktu odwrotnej transkrypcji w celu oznaczenia ilościowego?
Po uzyskaniu cDNA produktu odwrotnej transkrypcji bardzo ważne jest, ile razy cDNA należy rozcieńczyć do eksperymentów qPCR.Jeśli stężenie cDNA jest zbyt wysokie lub zbyt niskie, może to mieć wpływ na wydajność amplifikacji.Czy można zmierzyć stężenie cDNA i jak należy to zrobić?
(1) Nie można zmierzyć stężenia cDNA produktu odwrotnej transkrypcji, ponieważ oprócz produktu cDNA produkt odwrotnej transkrypcji zawiera również resztkowy bufor odwrotnej transkrypcji, odwrotną transkryptazę, startery itp., które będą zakłócać wyniki pomiaru stężenia i powodować nieprawidłowy stosunek OD260/280, OD260/230, a zatem nie odzwierciedla rzeczywistej wydajności cDNA.W tym czasie niektórzy przyjaciele powiedzą, że zmierzę stężenie po oczyszczeniu;tutaj Foregene chciałby przypomnieć, że nie zaleca się oczyszczania cDNA, ponieważ długość cDNA otrzymanego przez odwrócenie jest inna, a krótki cDNA zostanie utracony podczas oczyszczania.
(2) Więc co robić?Przed eksperymentem qPCR gradient rozcieńczenia cDNA można określić w ramach eksperymentu wstępnego.Na przykład: użyj roztworu podstawowego cDNA, 10-krotnego rozcieńczenia i 100-krotnego rozcieńczenia jako matryc do eksperymentów qPCR i wybierz współczynnik rozcieńczenia o wartości CT w zakresie 18-28.

W jaki sposób miRNA powinno podlegać odwrotnej transkrypcji?
miRNA to jednoniciowy, małocząsteczkowy RNA o wielkości około 22 nt, który nie koduje białka.Ze względu na swoją krótką długość konwencjonalna metoda qPCR jest trudna do bezpośredniego oznaczenia ilościowego, dlatego często konieczne jest wydłużenie miRNA;powszechnie stosowane metody odwrotnej transkrypcji miRNA obejmują metodę macierzystej pętli i metodę ogonowania.
Metoda pnia-pętli polega na wydłużaniu miRNA przez dodanie starterów pnia-pętli.Ta metoda wykrywania ma wyższą czułość i swoistość, ale przepustowość wykrywania jest niska.Jedna odwrotna transkrypcja może wykryć tylko jedno miRNA i wewnętrzne odniesienie;metoda dodawania ogona składa się z dwóch. Uzupełnia ją wspólne działanie dwóch enzymów, którymi są polimeraza PolyA i odwrotna transkryptaza.Polimeraza poliA jest odpowiedzialna za dodawanie ogonów poliA do miRNA w celu zwiększenia jego długości, a odwrotna transkryptaza przeprowadza reakcję odwrotnej transkrypcji.Ta metoda ma wysoką przepustowość wykrywania i może wykryć wiele miRNA i wewnętrznych odniesień w jednej odwrotnej transkrypcji, ale czułość i specyficzność są niskie w metodzie macierzy-pętli.