RNazy to wrażliwe słowo, którego wielu studentów często przeprowadzających eksperymenty z ekstrakcją RNA nie chce słyszeć.W pełni uzbrojony RNA, który ostatecznie wyekstrahowano wysoce toksycznymi odczynnikami, fenolem i chloroformem, uległ degradacji.nie jestem pogodzona!!!Dziś przyjrzyjmy się pochodzeniu słynnego Rnazy.

Rybonukleaza (RNaza) lub RNaza to nukleaza, która może hydrolizować RNA do małych cząsteczek.RNaza, jako białko małocząsteczkowe, jest niezwykle stabilna .Konwencjonalna wysokotemperaturowa i wysokociśnieniowa sterylizacja parowa oraz inhibitory białek nie mogą go całkowicie zdezaktywować.Stabilność RNazy wynika głównie z wiązań dwusiarczkowych w strukturze.Na przykład powszechnie stosowana RNaza trzustki bydlęcej ma tylko 124 aminokwasy, ale zawiera 4 wiązania dwusiarczkowe.Wiązanie siarkowe i wiązanie disiarczkowe nadają RNazie doskonałą stabilność termiczną.Ponadto rnaza ma stosunkowo małą masę cząsteczkową iw wielu przypadkach może szybko przywrócić pierwotną konformację.

Oprócz tego, że jest wyjątkowo stabilny,RNazy są wszechobecne w laboratorium .RNaza jest biologicznym mechanizmem obronnym.Dla komórki egzogenny RNA jest często śmiertelny.W porównaniu z egzogennym DNA, egzogenny RNA jest często bardziej niebezpieczny.RNA jest szczęśliwie transkrybowane i tłumaczone, więc prawie wszystkie organizmy wyewoluowały RNazy, aby bronić się przed inwazją egzogennego RNA.Dlatego komórki bakteryjne hodowane w laboratorium i ty, który ekstrahujesz RNA wydzielają aromat RNazy.Płyny ustrojowe człowieka (ślina, łzy itp.) zawierają dużą ilość RNazy, więc nie płacz, gdy RNA ulegnie degradacji.Im więcej płaczesz, tym gorsza degradacja RNA!!Siostra Daiyu nie nadaje się do ekstrakcji RNA!

Ponadto Twoja delikatna skóra zawiera również dużo RNaz, a markery, pipety, drzwi lodówki i klamki drzwi, które zostały dotknięte przez skórę, również zawierają RNazy.

Przy tak wielu wędrówkach, przyjrzyjmy się, jak radzić sobie z RNazami.

Pierwszą rzeczą, o której wszyscy myślą podczas usuwania RNA, jestDEPC(pirowęglan dietylu).DEPC głównie denaturuje białko, łącząc się z pierścieniem imidazolowym aktywnej grupy RNazy, histydyny, hamując w ten sposób aktywność enzymu.0,1% DEPC może mieć lepszy efekt usuwania Rnazy, ale musimy zwrócić uwagę, że DEPC jest znanym czynnikiem rakotwórczym, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas jego stosowania.

W przypadku RNazy musimy zacząć od dwóch aspektów,pierwszym jest hamowanie aktywności endogennej RNazy

Konwencjonalne odczynniki do ekstrakcji RNA, takie jak izotiocyjanian guanidyny i DTT zawarte w Trizolu, mogą otwierać wiązania dwusiarczkowe RNazy, ale nadal występują pewne RNazy, zwłaszcza w próbkach tkanek, dlatego należy zwracać uwagę na niską temperaturę.

1.Natychmiast po wyjęciu zanurz próbkę tkanki w ciekłym azocie lub w dostępnym w handlu roztworze do konserwacji RNA.

2.Po ekstrakcji RNA z próbki komórek dodać ją do roztworu do lizy i poddać lizie w pojemniku na lód

3. Do szlifowania najlepiej używać ciekłego azotu gdy próbki tkanek są homogenizowane.Używając homogenizatora elektrycznego bez ciekłego azotu, należy zwrócić uwagę na całkowite wstępne schłodzenie adaptera homogenatu.

Drugi to egzogenna DNaza

1.Bądź w pełni uzbrojony, załóż fartuch laboratoryjny, załóż maskę i pamiętaj o założeniu pary nowych rękawiczek (nie bądź taki oszczędny!! Należy zauważyć, że Trizol jest bardzo żrący i jest również bardzo silny przez rękawiczki, więc nie kapać na ręce).

2.Wszystkie używane końcówki do pipet, probówki EP, probówki do PCR i inny sprzęt muszą być oczyszczone z RNazy.Można go namoczyć w 0,1% DEPC, a następnie poddać działaniu wysokiego ciśnienia.Zwróć uwagę na działanie pod wyciągiem.Lokalni tyrani mogą bezpośrednio kupować materiały eksploatacyjne do usuwania enzymów.

PS: Pozwól, że powiem ci leniwą metodę.Chociaż wysoka temperatura i wysokie ciśnienie nie mogą całkowicie usunąć RNazy, usuną dużą jej część.2-krotność wysokiej temperatury i wysokiego ciśnienia ma dobry efekt, a ekstrakcja RNA ma niewielki wpływ.

3.Alkohol może denaturować białka,więc stół do ekstrakcji RNA można przetrzeć 75% alkoholem , a rękawiczki można również spryskać alkoholem.

4.Końcowy roztwór rozpuszczający RNA i probówkę wirówkową również należy poddać de-RNazie.Woda DEPC jest powszechnie stosowanym roztworem rozpuszczającym RNA.Porozmawiajmy o prawidłowej metodzie przygotowania wody DEPC (pamiętaj o przepakowaniu komercyjnego DEPC przy zakupie)

Dodaj DEPC do ultraczystej wody w stosunku 1:1000, dobrze wstrząśnij, pozostaw na noc w temperaturze 37°C i sterylizuj w temperaturze 121°C w wysokiej temperaturze i pod wysokim ciśnieniem przez 15 minut.Wodę DEPC można przechowywać w temperaturze -20°C w porcjach po 1 ml.

Na koniec podsumowując: kluczem jest niska temperatura, dobra obsługa materiałów eksploatacyjnych, pełne uzbrojenie i mniej gadania!

Cóż, to tyle jeśli chodzi o dzisiejszą strategię.Życzę wszystkim wspomnianej koncentracji i czystości RNA.Oba A260/A280 mają 2.0!!!

Oczywiście, jeśli używasz npzestaw do ekstrakcji RNA do pracy w temperaturze pokojowej, możesz nie napotkać powyższych problemów.

Działanie w temperaturze pokojowej, bez dodatku DNazy, pozwala na ekstrakcję całkowitego RNA z komórek w ciągu 11 minut i ekstrakcję całkowitego RNA z tkanek zwierzęcych lub roślinnych w ciągu 30 minut.

W sprawie próbek próbnych prosimy o kontakt:overseas@foregene.com

Produkty powiązane:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/