Wskazówki dotyczące poprawy odzyskiwania kleju

1. Zwiększ obciążenie próbki podczas elektroforezy.

2. Użyj świeżo przygotowanego buforu do elektroforezy.

3. Podczas cięcia kleju staraj się ciąć tylko klej paskami, aby zmniejszyć objętość cięcia kleju: nie potrzebujesz kleju z kilkoma fragmentami celu, w przeciwnym razie wpłynie to na szybkość regeneracji.

4. Po stopieniu dwóch lub więcej kawałków kleju użyj tuby bez względu na to, jak duża jest objętość i przenieś ją do tej samej kolumny.

5. Roztworu dodawanego w zolu można trochę więcej, co bardziej sprzyja wiązaniu DNA z membraną, ale generalnie nie przekraczać 750ul.

6. Kluczem do odzyskania żelu jest związanie DNA z kolumną poprzez stężenie soli, kwasowość (ładunek) i hydrofobowość roztworu w kolumnie.Dlatego też, jeśli pH buforu do elektroforezy jest zbyt wysokie, do zolu można dodać 10 ul (pH 5,0, 3 mol/l NaAC);w celu lepszego przechwytywania cząsteczek DNA na membranie, po rozpuszczeniu kleju można dodać 30% izopropanolu w celu podgrzania płynu.

7. Przed dodaniem eluentu pozostaw kolumnę w temperaturze pokojowej na kilka minut (około 10 minut) do całkowitego odparowania etanolu.

8. Na koniec dodaj mniej eluentu, aby zminimalizować objętość odzysku.Generalnie do elucji stosuje się 30-50μl eluentu (nie za mało, w przeciwnym razie nie będzie w stanie zwilżyć membrany, co nie sprzyja elucji);kropelki elucji znajdują się w środku membrany, aby całkowicie wymyć DNA związane z membraną.

9. Po dodaniu eluentu można go eluować w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni przez 5 minut lub umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni przez ponad 10 minut lub uszczelnić parafilmem w temperaturze 4 stopni przez noc, a następnie odwirować w celu odzyskania następnego dnia, efekt jest dobry.

10. Dodać odwirowany eluat z powrotem do kolumny adsorpcyjnej i ponownie odwirować.

Szczegółowe metody i procedury odzyskiwania produktów PCR

1. Zwykły recykling gumy

Jeśli chcesz odzyskać klej, najlepiej użyć zestawu, który jest wygodny i ma nieco wyższy współczynnik regeneracji.Jeśli naprawdę musisz odzyskać go ręcznie, możesz dodać 3-krotną objętość TE po odcięciu kleju.Po stopieniu w łaźni wodnej fenol, fenol/chloroform są ekstrahowane w sposób czysty i wytrąca się etanol.Otóż ​​to.

2. Odzyskiwanie DNA z żeli o niskiej temperaturze topnienia

Oczyszczanie fragmentów DNA Dodać TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) w ilości równej objętości żelu i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 65°C na 5 minut w celu całkowitego rozpuszczenia żelu.

Po doprowadzeniu do temperatury pokojowej dodano równą ilość fenolu (nasycony TE, TE uszczelniono w górnej warstwie, a dolną warstwę fenolu usunięto), mieszaninę delikatnie wymieszano (nie wymaga mieszania) i odwirowano przy 12 000 obr./min przez 3 minuty.Powtórz 1-2 razy.

Wziąć supernatant, dodać 0,1 objętości 3 mol/l octanu sodu (pH 5,2) i 2,5-krotność objętości etanolu absolutnego w celu przeprowadzenia strącania etanolem.Oczyszczone DNA rozpuścić w odpowiedniej ilości TE, zmierzyć zawartość i przygotować do użycia (można go użyć do analizy struktury docelowego genu, przygotowania sondy itp.).

3. Odzysk PCR z dobrą specyficznością amplifikacji

Jeśli specyficzność amplifikacji PCR jest dobra, wystarczy proste oczyszczenie i odzyskanie produktu PCR.Możesz dodać 50 ug/ml proteinazy K do produktu PCR, 37 stopni przez 1 godzinę, ekstrahować raz fenolem/chloroformem, raz ekstrahować chloroformem i dodać 0,1 objętości supernatantu.Octan sodu odzyskano przez wytrącenie 2,5 objętościami absolutnego etanolu.

Produkty powiązane:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/