Przegląd
Szybka identyfikacja roślin transgenicznych
Tekst/Tong Yucheng
Operacja eksperymentalna / Han Ying
Redaktor/Wen Youjun
Słowa/1600+
Sugerowany czas czytania/8-10 minut
Szybka identyfikacja roślin transgenicznych
Jako nowicjusz w laboratorium nie jest dobrym zadaniem odsiewanie pozytywnych roślin z grupy roślin o niskim współczynniku konwersji.Po pierwsze, DNA musi zostać wyekstrahowane z dużej liczby próbek jedna po drugiej, a następnie obce geny zostaną wykryte metodą PCR.Jednak wyniki są często puste i czasami zawierają kilka elementów, ale nie można określić, czy są to pominięte lub fałszywe wykrycia..Czy zmierzenie się z takim eksperymentalnym procesem i wynikami jest bardzo bezradne?Nie martw się, brat uczy cię, jak łatwo i dokładnie odfiltrowywać transgeniczne pozytywne rośliny.
Krok 1: Startery do wykrywania projektu
Określ gen endogenny i gen egzogenny do wykrycia zgodnie z próbką do przetestowania i wybierz reprezentatywną sekwencję 100-500 pz w genie do zaprojektowania startera.Dobre startery mogą zapewnić dokładność wyników detekcji i skrócić czas detekcji (patrz dodatek do powszechnie stosowanych starterów do detekcji).
Notatka:
Nowo zaprojektowane startery muszą zoptymalizować warunki reakcji i zweryfikować dokładność, precyzję i granicę wykrywalności wykrywania przed wykonaniem wykrywania na dużą skalę.
Krok 2:Opracuj protokół eksperymentalny
Kontrola pozytywna: Użyj oczyszczonego DNA zawierającego docelowy fragment jako matrycy, aby określić, czy system i warunki reakcji PCR są normalne.
Kontrola negatywna/pusta: Użyj matrycy DNA lub ddH2O, który nie zawiera docelowego fragmentu jako matrycy do wykrywania, czy w systemie PCR istnieje źródło zanieczyszczenia.
Wewnętrzna kontrola referencyjna: użyj kombinacji starter/sonda endogennego genu badanej próbki, aby ocenić, czy matryca może zostać wykryta metodą PCR.
Notatka:
Dla każdego testu należy ustawić kontrole pozytywne, negatywne/ślepe i kontrole kontroli wewnętrznej, aby ocenić ważność wyników eksperymentu.
Krok 3: Przygotowanie eksperymentu
Przed użyciem należy obserwować, czy roztwór jest równomiernie wymieszany.W przypadku wytrącenia osadu przed użyciem należy go rozpuścić i wymieszać zgodnie z instrukcją.Mieszankę 2×PCR należy przed użyciem pipetować i wielokrotnie mieszać za pomocą mikropipety, aby uniknąć nierównomiernego rozkładu jonów.
Notatka:
Wyjmij instrukcje i przeczytaj je uważnie, a przed eksperymentem przygotuj się ściśle według instrukcji.
Krok 4: Przygotuj system reakcji PCR
Zgodnie z protokołem doświadczalnym wymieszać startery, H2O, 2×PCR wymieszać, odwirować i rozprowadzić do każdej probówki reakcyjnej.
Notatka:
W przypadku testów na dużą skalę lub długotrwałych zaleca się stosowanie systemu reakcji PCR zawierającego enzym UNG, który może skutecznie zapobiegać zanieczyszczeniu aerozolem powodowanemu przez produkty PCR.
Krok 5: Dodaj szablon reakcji
Dzięki zastosowaniu technologii Direct PCR nie ma potrzeby żmudnego procesu oczyszczania kwasów nukleinowych.Matrycę próbki można przygotować w ciągu 10 minut i dodać do odpowiedniego systemu reakcji PCR.
Notatka:
Metoda lizy ma lepszy efekt detekcji, a otrzymany produkt może być wykorzystany do wielu reakcji detekcji.
5.1: Bezpośredni PCR liści
Zgodnie z rozmiarem rysunku w instrukcji, wytnij tkankę liścia o średnicy 2-3mm i umieść ją w systemie reakcji PCR.
Uwaga: Upewnij się, że fragmenty liści są całkowicie zanurzone w roztworze reakcyjnym PCR i nie dodawaj nadmiernej ilości tkanki liściowej.
5.2: Metoda lizy liści
Wytnij tkankę liścia o średnicy 5-7 mm i umieść ją w probówce wirówkowej.Jeśli wybierzesz dojrzałe liście, unikaj używania tkanek głównej żyły liścia.Wpipetować 50 ul lizatu Buffer P1 do probówki wirówkowej, aby upewnić się, że lizat może całkowicie zanurzyć tkankę liścia, umieścić go w termocyklerze lub łaźni metalowej i lizować w temperaturze 95°C przez 5-10 minut.
Dodać 50 ul roztworu neutralizującego Buffer P2 i dobrze wymieszać.Otrzymany lizat można wykorzystać jako matrycę i dodać do systemu reakcji PCR.
Uwaga: Ilość matrycy powinna wynosić 5-10% systemu PCR i nie powinna przekraczać 20% (np. w systemie PCR 20 μl dodać 1-2 μl buforu do lizy, nie więcej niż 4 μl).
Krok 6: Reakcja PCR
Po odwirowaniu probówki reakcyjnej do PCR umieść je w aparacie PCR w celu amplifikacji.
Notatka:
Reakcja wykorzystuje nieoczyszczoną matrycę do amplifikacji, więc liczba cykli amplifikacji jest o 5-10 cykli większa niż przy użyciu oczyszczonej matrycy DNA.
Krok 7: Detekcja elektroforezy i analiza wyników
Drabina DNA M:100 bp
1\4: Metoda oczyszczonego DNA
2\5: Bezpośrednia metoda PCR
3\6: Pusta kontrola
Kontrola jakości:
Wyniki badań różnych zestawów kontrolnych w eksperymencie powinny spełniać następujące warunki.W przeciwnym razie należy przeanalizować przyczynę problemu i po wyeliminowaniu problemu wykonać ponownie badanie.
Tabela 1. Normalne wyniki testów różnych grup kontrolnych
*Gdy plazmid jest używany jako kontrola pozytywna, wynik testu genu endogennego może być ujemny
Ocena wyniku:
A. Wynik testu endogennego genu próbki jest ujemny, co wskazuje, że DNA nadające się do zwykłego wykrywania metodą PCR nie może zostać wyekstrahowane z próbki lub wyekstrahowany DNA zawiera inhibitory reakcji PCR i DNA należy ponownie wyekstrahować.
B. Wynik testu endogennego genu próbki jest pozytywny, a wynik testu egzogennego genu jest ujemny, co wskazuje, że DNA odpowiednie do zwykłego wykrywania PCR jest ekstrahowane z próbki i można ocenić, że gen XXX nie został wykryty w próbce.
C. Wynik testu genu endogennego w próbce jest pozytywny, a wynik testu genu egzogennego jest pozytywny, co wskazuje, że z próbki wyekstrahowano DNA odpowiednie do zwykłego wykrywania metodą PCR, a DNA próbki zawiera gen XXX.Eksperymenty potwierdzające mogą być dalej przeprowadzane.
Krok 8: Zaprojektuj startery wykrywające
Po eksperymencie użyj 2% roztworu podchlorynu sodu i 70% roztworu etanolu, aby wytrzeć obszar eksperymentu, aby zapobiec zanieczyszczeniu środowiska.
Załącznik
Tabela 2. Powszechnie stosowane startery do ogólnego wykrywania metodą PCR roślin zmodyfikowanych genetycznie
Dokument referencyjny:
SN/T 1202-2010, Jakościowa metoda wykrywania metodą PCR genetycznie zmodyfikowanych składników roślinnych w żywności.
Komunikat Ministerstwa Rolnictwa 1485-5-2010, Badania składników roślin genetycznie modyfikowanych i ich przetworów- ryżu M12 i jego pochodnych.
Czas postu: 09-06-2021
