Wszyscy mówią o zasadzie eksperymentu qRT-PCR, projektowaniu starterów, interpretacji wyników itp., ale myślę, że powinienem podzielić się z wami eksperymentalnym działaniem qRT-PCR.Jest mały, ale chodzi o wyniki.
Przed wykonaniem qRT-PCR musimy mieć jasne zrozumienie własnego RNA i metod operacyjnych.W końcu nasze wysiłki mają na celu uzyskanie wyników, a nie tylko ćwiczenie.Dlatego przed wykonaniem qRT-PCR musimy ustalić następujące kwestie (niektóre z nich dotyczą tylko SYBR).
1 Czy jesteś pewien, że twoje RNA nie jest zdegradowane?
NanoDrop 2000 może wykryć jedynie stężenie i czystość RNA, ale nie może wykryć integralności RNA.
Wartość RNA (RNA Intesity Number) może odzwierciedlać integralność RNA, która jest wykrywana przez system Agilent 2100 Bioanalyzer.
Ryc. Schematyczny diagram wartości RIN dla różnych próbek RNA (eukariota)
Jednak laboratoria na ogół nie mają bioanalizatora Agilent 2100.W tym przypadku możemy wykryć za pomocą żelu formaldehydowego, ale zapotrzebowanie na całkowitą ilość RNA jest wysokie, więc najszybszą metodą jest zastosowanie zwykłej elektroforezy żelowej.Wymagane jest przebywanie w środowisku wolnym od nukleaz, dlatego konieczne jest przepłukanie zbiornika do elektroforezy, butelki zolem, wspornika żelowego i grzebienia wodą DEPC.Agaroza jest również wolna od nukleaz (o ile jest świeżo otwarta), a bufor ładujący powinien być świeżo otwierany tak często, jak to możliwe, z 1,2% żelem.
Należy pamiętać, że żel musi być całkowicie rozpuszczony, w przeciwnym razie spowoduje powstanie niejednorodnych prążków, jak pokazano na próbce 9 na rysunku.Jeśli napięcie jest zbyt wysokie lub działa zbyt długo, będzie generować ciepło i powodować degradację RNA, dlatego należy rozsądnie kontrolować napięcie i czas.Ponadto żelowanie może również dodatkowo określić, czy w próbce znajdują się pozostałości DNA i zaobserwować, czy w studzience dozującej znajduje się duża liczba zatrzymanych prążków.
Postać.Elektroforeza żelowa do wykrywania RNA
2 Czy jesteś pewien stężenia swojego cDNA?
Doświadczenie starszych braci w laboratorium jest takie, że cDNA systemu 20 ul otrzymanego przez każdą inwersję jest bezpośrednio rozcieńczany 20X, podczas gdy siostry ze stopniem doktora są rozcieńczane 10X.Zazwyczaj uzależniam się od sytuacji.Ponieważ jakość RNA wymieniona przez każdą osobę jest inna, poziom odwrócenia jest również inny, a technologia odwrócenia może nie być stabilna.
Więc za każdym razem, gdy otrzymuję odwrócony cDNA, najpierw rozcieńczam go około 3 razy, a następnie używam genu podstawowego do wykonania RT-PCR, liczba cykli wynosi zazwyczaj 25 cykli, aby zidentyfikować określone stężenie, a następnie określić końcowy współczynnik rozcieńczenia.
3 Czy jesteś pewien, że Twoje podkłady są łatwe w użyciu?
Może przejść przez krzywą topnienia qRT-PCR, ale to wciąż kosztuje.W przypadku laboratoriów, które nie mają dużo pieniędzy, gdy otrzymują dużo starterów, mogą użyć zwykłego RT-PCR, aby sprawdzić, czy jest to pojedynczy prążek i określić specyficzność starterów.Jeśli laboratorium nie brakuje pieniędzy, specyficzność wszystkich starterów można określić raz na podstawie krzywej topnienia.
4 Czy jesteś pewien, że twoje warunki doświadczalne są odpowiednie?
SYBR należy chronić przed silnym światłem, dlatego podczas dodawania odczynnika SYBR staraj się wyłączać górne światło i wystarczy użyć słabego światła, aby dokończyć.
Przechowywać SYBR w temperaturze 4°C.Podczas używania delikatnie obracaj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać, aby uniknąć pienienia, i nie wiruj energicznie.
Niektóre młodsze siostry lubią rysować znaki na tablicy PCR z obawy przed pomieszaniem próbek, co jest złe.Ponieważ twoje markery z dużym prawdopodobieństwem wpłyną na zbieranie sygnałów fluorescencyjnych, generalnie polecam juniorom korzystanie z eksperymentalnych notatników, aby pomóc w zapamiętywaniu, jak pokazano poniżej.
Postać.Schemat ładowania próbki qRT-PCR
5 Czy na pewno robisz to dobrze?
Pamiętaj, aby nosić rękawiczki, nosić rękawiczki, nosić rękawiczki i trzy razy mówić ważne rzeczy.
Aby zmniejszyć ekspozycję SYBR na światło, osobiście lubię najpierw dodać szablon, jak pokazano na poniższym rysunku.Z doświadczenia wynika, że dodanie niewielkiej ilości szablonu może spowodować błędy w próbkowaniu.Dlatego, aby zminimalizować błąd spowodowany dodaniem małej ilości szablonu, zwykle ponownie podwajam próbkę i podwajam ilość podczas dodawania próbki, aby zmniejszyć ilość dodawanego H2O2.
Postać.Schematyczny diagram ładowania qRT-PCR
Następnie skonfiguruj system qRT-PCR w następujący sposób.
Postać.Schemat przygotowania systemu qRT-PCR
UWAGA: Proces konfiguracji należy przeprowadzić na lodzie.
Po dodaniu próbki wklej przezroczystą folię uszczelniającą.Staraj się nie dotykać rękami powierzchni przezroczystej folii uszczelniającej, po prostu operuj z przestrzeni po obu stronach folii.Ponieważ odciski palców mogą również wpływać na zbieranie sygnałów fluorescencyjnych.Następnie użyj wirówki, aby szybko wirować przez 10 s na niskich obrotach, aby zapobiec zawieszaniu się próbki na ścianie.
Produkty powiązane:
Czas postu: 28-04-2023
