Ile wiesz

O NEkstrakcja kwasu nukleinowego

Początek i koniec oczyszczonego kwasu nukleinowego

Na początku wszystko jest trudne, najbardziej oczyszczony kwas nukleinowy

Inicjowanie eksperymentów molekularnych, do kolejnych eksperymentów

Sukces lub porażka ma decydujący wpływ.

Spektrofotometr UV śladowy/ultra-śladowy jest preferowany przez wielu badaczy naukowych, ponieważ może wykryć stężenie kwasu nukleinowego oraz pozostałości białek i jonów soli w prosty, szybki i ekonomiczny sposób.

Jak wszyscy wiemy, A260 oznacza wartość OD absorbancji kwasu nukleinowego, A280 oznacza wartość OD absorbancji stężenia białka, A230 oznacza wartość OD absorbancji stężenia jonów soli, więc A260 może konwertować stężenie kwasu nukleinowego, A260/280 oznacza resztę białka, A260/230 oznacza pozostałość jonu soli, ale jest to tylko reguła odkryta przez badaczy na podstawie dużej liczby wyników pomiarów i jest ”standardowy”, aby uwierzyć, że może to wyjaśnić czystość DNA i RNApewnym stopniu.Nie jest to jedyny standard do identyfikacji wydajności i czystości kwasu nukleinowego, jest używany jedynie jako odniesienie i nie jest „złotym standardem”.

Instrukcja Thermo Fisher ND-2000 podkreśla wiarygodność wyników testu

Powodem jest to, że wyniki uzyskane za pomocą spektrofotometru mikro/ultramikro UV odzwierciedlają tylko wydajność i czystość kwasu nukleinowego z boku, a istnieje wiele czynników wpływających (ścieżka optyczna, objętość próbki, stężenie próbki, wartość pH, inne jony, które wpływają na pomiar absorbancji itp.), zmierzona wartość OD niekoniecznie jest dokładna.Jednocześnie, ze względu na brak specyficzności materiału do oznaczania wartości absorbancji, jednoniciowe DNA, dwuniciowe DNA, RNA, dNTP i niektóre białka mają piki absorpcji przy długości fali 260 nm, a stężenie określone przez sam A260 niekoniecznie jest rzeczywistym DNA lub RNA.Koncentracja, jej integralność i degradacja nie mogą być oceniane.

Jak więc ocenić jakość naszego oczyszczonego kwasu nukleinowego?Oprócz stosowania mikro/ultramikrospektrofotometru UV do wykrywania, metody takie jak elektroforeza w żelu agarozowym są również wymagane do wizualnego przedstawienia czystości i integralności kwasu nukleinowego oraz do wskazania stężenia do pewnego stopnia.W ten sposób wydajność i czystość kwasu nukleinowego uzyskane na podstawie wyników wykrywania różnymi metodami są wiarygodne.

Eksperymentalne porównanie wykresów

Genomowe DNA komórek H1299 zostało wyekstrahowane przy użyciu zestawów do ekstrakcji DNA firmy A i zaobserwowano znaczne zanieczyszczenie, co skutkowało wysokimi wartościami OD

(Wartość pomiaru OD i odpowiedni elektroforogram)

Indeks oceny

Czy istnieje „złoty standard” wydajności i jakości kwasów nukleinowych?

O ile nam wiadomo, nie ma prostej, szybkiej i taniej metody.Niezależnie od tego, czy jest to spektrofotometr, elektroforeza żelowa czy spektrometria mas, wszystkie odzwierciedlają stężenie i czystość kwasu nukleinowego w roztworze z różnych aspektów i należy je oceniać, odnosząc się do siebie.

Najlepszym wskaźnikiem oceny jest zawszekontynuacja aplikacji eksperymentalnej.Nie wpływa na wydajność odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR.Uzyskanie wiarygodnych produktów amplifikacji i wartości Ct oraz uzyskanie kompletnej sekwencji przez sekwencjonowanie jest skuteczną ekstrakcją kwasu nukleinowego.

Podsumowując, pogląd teorii wyłącznie proporcji powinien zostać zakwestionowany przez pogląd „wykorzystywania dobrych dalszych wyników eksperymentalnych jako dobrych parametrów ekstrakcji”!

Zalecane zestawy do ekstrakcji DNA RNA firmy Foregene w celu uzyskania wysokiej czystości DNA/RNA:

https://www.foreivd.com/reagent/dna-isolation-series/

https://www.foreivd.com/reagent/rna-isolation-series/