Real Time PCR, znany również jako ilościowy PCR lub qPCR, to metoda monitorowania i analizy w czasie rzeczywistym produktów amplifikacji PCR.
Ponieważ ilościowy PCR ma zalety prostej obsługi, szybkości i wygody, wysokiej czułości, dobrej powtarzalności i niskiego stopnia zanieczyszczenia, jest szeroko stosowany w testach medycznych, ocenie skuteczności leków, badaniach ekspresji genów, badaniach transgenicznych, wykrywaniu genów, wykrywaniu patogenów, wykrywaniu zwierząt i roślin., testowanie żywności i inne dziedziny.
Dlatego niezależnie od tego, czy zajmujesz się badaniami podstawowymi w naukach przyrodniczych, czy też jesteś pracownikami firm farmaceutycznych, firm zajmujących się hodowlą zwierząt, firmami spożywczymi, a nawet pracownikami biur kontroli wjazdowo-wyjazdowej i kwarantanny, działów monitoringu środowiska, szpitali i innych jednostek, będziesz mniej lub bardziej narażony na Lub musisz znać wiedzę z zakresu opanowania ilościowego PCR.

Zasada PCR w czasie rzeczywistym

Real Time PCR to metoda, w której do układu reakcji PCR dodaje się substancje fluorescencyjne, a intensywność sygnału fluorescencji w procesie reakcji PCR jest monitorowana w czasie rzeczywistym za pomocą ilościowego aparatu PCR, a na koniec dane eksperymentalne są analizowane i przetwarzane.

【Krzywa amplifikacji】jest krzywą opisującą dynamiczny proces PCR.Krzywa amplifikacji PCR nie jest w rzeczywistości standardową krzywą wykładniczą, ale krzywą sigmoidalną.

[Faza platformy krzywej amplifikacji]Wraz ze wzrostem liczby cykli PCR, inaktywacją polimerazy DNA, wyczerpywaniem dNTP i starterów oraz hamowaniem reakcji syntezy przez produkt uboczny reakcji, pirofosforan itp., PCR nie zawsze rozszerza się wykładniczo.i w końcu wejdzie na płaskowyż.

[Obszar wzrostu wykładniczego krzywej amplifikacji]Chociaż faza plateau jest bardzo zróżnicowana, w pewnym obszarze obszaru wzrostu wykładniczego krzywej amplifikacji powtarzalność jest bardzo dobra, co jest bardzo ważne dla ilościowej analizy PCR.

[Wartość progowa i wartość Ct]Ustawiliśmy wartość graniczną detekcji fluorescencji w odpowiednim miejscu w obszarze wzrostu wykładniczego krzywej amplifikacji, a mianowicie wartość progową (Threshold).Przecięcie wartości progowej i krzywej amplifikacji to wartość Ct, to znaczy wartość Ct odnosi się do liczby cykli (cykl progowy), po których osiągnięta zostaje wartość progowa.

Poniższy wykres wyraźnie pokazuje zależność między linią progową a krzywą amplifikacji, wartością progową i Ct.

【Jak oszacować?】

Teoria matematyczna udowodniła, że ​​wartość Ct ma odwrotną zależność liniową od logarytmu liczby szablonów początkowych.Real Time PCR monitoruje produkty amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym i ocenia je ilościowo podczas wykładniczej fazy amplifikacji.

Dla każdego cyklu PCR DNA wzrastało wykładniczo 2-krotnie i wkrótce osiągało plateau.

Zakładając, że ilość wyjściowego DNA wynosi A₀ , po n cyklach teoretyczną ilość produktu DNA można wyrazić jako:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Wtedy, im większa jest początkowa ilość DNA A0, tym szybciej ilość zamplifikowanego produktu osiąga wartość wykrywania An, a liczba cykli po osiągnięciu An jest wartością Ct.Oznacza to, że im większa jest początkowa ilość DNA A0, tym wcześniej osiąga szczyt krzywej amplifikacji i odpowiednio mniejsza jest wymagana liczba cykli n.

Wykonujemy rozcieńczenia gradientowe wzorca o znanym stężeniu i używamy go jako matrycy do PCR w czasie rzeczywistym, aw równych odstępach otrzymamy serię krzywych amplifikacji w kolejności wyjściowej ilości DNA od większej do mniejszej.Zgodnie z liniową zależnością między wartością Ct a logarytmem liczby szablonów startowych, aMożna utworzyć [krzywą standardową].

Podstawiając wartość Ct próbki o nieznanym stężeniu do krzywej wzorcowej, można otrzymać początkową ilość matrycy próbki o nieznanym stężeniu, co jest ilościową zasadą Real Time PCR.

Metoda wykrywania Real Time PCR

Real Time PCR wykrywa produkty amplifikacji PCR poprzez wykrywanie intensywności fluorescencji w układzie reakcyjnym.

Zasada metody osadzania barwnika fluorescencyjnego】

Barwniki fluorescencyjnetakie jak TB Green®, mogą nieswoiście wiązać się z dwuniciowym DNA w systemach PCR i fluoryzować po związaniu.

Intensywność fluorescencji w układzie reakcyjnym rosła wykładniczo wraz ze wzrostem liczby cykli PCR.Dzięki wykrywaniu intensywności fluorescencji ilość amplifikacji DNA w układzie reakcyjnym może być monitorowana w czasie rzeczywistym, a następnie ilość wyjściowej matrycy w próbce może być oszacowana w sposób odwrotny.

【Zasada metody sondy fluorescencyjnej】

sonda fluorescencyjnajest sekwencją kwasu nukleinowego z grupą fluorescencyjną na końcu 5' i grupą wygaszającą na końcu 3', która może specyficznie wiązać się z matrycą.Gdy sonda jest nienaruszona, fluorescencja emitowana przez fluorofor jest wygaszona przez grupę wygaszającą i nie może fluoryzować.Gdy sonda ulegnie rozkładowi, substancja fluorescencyjna ulegnie dysocjacji i wyemituje fluorescencję.

Do roztworu reakcyjnego PCR dodaje się sondę fluorescencyjną.Podczas procesu wyżarzania sonda fluorescencyjna zwiąże się z określoną pozycją matrycy.Podczas procesu wydłużania aktywność egzonukleazy 5′→3′ enzymu PCR może rozłożyć sondę fluorescencyjną zhybrydyzowaną z matrycą, a substancja fluorescencyjna ulega dysocjacji, emitując fluorescencję.Wykrywając intensywność fluorescencji sondy w układzie reakcyjnym, można osiągnąć cel monitorowania ilości amplifikacji produktu PCR.

【Wybór metody detekcji fluorescencji】

Metoda z sondą fluorescencyjną jest niezastąpiona w przypadku zastosowania jej do rozróżnienia sekwencji o wysokiej homologii i przeprowadzenia multipleksowej detekcji PCR, takiej jak analiza typowania SNP.
W przypadku innych eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym można zastosować prostą, łatwą i tanią metodę chimery fluorescencyjnej.

sondySilna specyficzność, zdolna do multipleksowego PCR

Niedociągnięcie

Wymagania dotyczące wysokiej specyficzności amplifikacji;

nie można przeprowadzić multipleksowego PCR Konieczność zaprojektowania specyficznych sond, wysoki koszt;

czasami konstrukcja sondy jest trudna

Produkty powiązane: