Wartość Ct jest najważniejszą formą prezentacji wyników fluorescencyjnej ilościowej reakcji PCR.Służy do obliczania różnic w ekspresji genów lub liczby kopii genów.Jaka zatem wartość Ct oznaczania ilościowego fluorescencji jest uważana za rozsądną?Jak zapewnić efektywny zakres wartości Ct?
Co to jest wartość Ct?
Podczas procesu amplifikacji qPCR odpowiednia liczba cykli amplifikacji (Próg cyklu), gdy sygnał fluorescencji zamplifikowanego produktu osiągnie ustawiony próg fluorescencji.C oznacza cykl, a T oznacza próg.Mówiąc najprościej, wartość Ct to liczba cykli odpowiadająca momentowi, w którym początkowa amplifikacja matrycy osiąga określoną ilość produktu w qPCR.Tak zwana „pewna ilość produktu” zostanie wyjaśniona później.
Co robi wartość Ct?
1. Związek między amplifikacją wykładniczą, ilością matrycy i wartością Ct
Idealnie, geny w qPCR są gromadzone przez wykładniczą amplifikację po określonej liczbie cykli.Zależność między liczbą cykli amplifikacji a ilością produktów jest następująca: Ilość amplifikowanego produktu = początkowa ilość matrycy × (1+En) liczba cykli.Jednak reakcja qPCR nie zawsze przebiega w idealnej sytuacji.Kiedy ilość amplifikowanego produktu osiąga „pewną ilość produktu”, liczba cykli w tym czasie jest wartością Ct i jest to w wykładniczym okresie amplifikacji.Zależność między wartością Ct a ilością matrycy wyjściowej: Istnieje liniowa zależność między wartością Ct matrycy a logarytmem numeru kopii wyjściowej matrycy.Im wyższe początkowe stężenie matrycy, tym mniejsza wartość Ct;im niższe początkowe stężenie matrycy, tym większa wartość Ct.
2. Krzywa amplifikacji, próg fluorescencji i określona ilość produktu PCR
Ilość produktu amplifikacji qPCR jest bezpośrednio prezentowana w postaci sygnału fluorescencyjnego, czyli krzywej amplifikacji.Na wczesnym etapie PCR amplifikacja odbywa się w idealnych warunkach, liczba cykli jest niewielka, akumulacja produktu jest niewielka, a poziom fluorescencji nie może być wyraźnie odróżniony od tła fluorescencji.Następnie fluorescencja wzrasta i wchodzi w fazę wykładniczą.Ilość produktu PCR można wykryć w pewnym momencie, gdy reakcja PCR znajduje się właśnie w fazie wykładniczej, którą można wykorzystać jako „pewną ilość produktu” iz tego można wywnioskować początkową zawartość matrycy.Dlatego intensywność sygnału fluorescencji odpowiadająca określonej ilości produktu jest progiem fluorescencji.
W późnym etapie PCR krzywa amplifikacji nie wykazuje już amplifikacji wykładniczej i wchodzi w fazę liniową i fazę plateau.
3.Odtwarzalność wartości Ct
Gdy cykl PCR osiągnie numer cyklu wartości Ct, właśnie wszedł w prawdziwy wykładniczy okres amplifikacji.W tym czasie mały błąd nie został wzmocniony, więc powtarzalność wartości Ct jest doskonała, to znaczy ta sama matryca jest amplifikowana w różnym czasie lub w różnych probówkach w tym samym czasie.Po amplifikacji uzyskana wartość Ct jest stała.
1.Sprawność wzmocnienia En
Wydajność amplifikacji PCR odnosi się do wydajności, z jaką polimeraza przekształca gen, który ma być amplifikowany, w amplikon.Wydajność amplifikacji, gdy jedna cząsteczka DNA jest przekształcana w dwie cząsteczki DNA, wynosi 100%.Wydajność amplifikacji jest powszechnie wyrażana jako En.W celu ułatwienia analizy kolejnych artykułów pokrótce przedstawiono czynniki wpływające na efektywność amplifikacji.
| Czynniki wpływające | wyjaśnienie | Jak osądzić? |
| A. Inhibitory PCR | 1. Matryca DNA zawiera substancje hamujące reakcję PCR, takie jak białka lub detergenty.2. cDNA po odwrotnej transkrypcji zawiera wysokie stężenie matrycy RNA lub składników odczynnika RT, które mogą również hamować późniejszą reakcję PCR. | 1. Czy występuje zanieczyszczenie, można ocenić, mierząc stosunek A260/A280 i A260/A230 lub elektroforezę RNA.2. Czy cDNA jest rozcieńczane w określonym stosunku po odwrotnej transkrypcji. |
| B. Niewłaściwy projekt podkładu | Podkłady nie wyżarzają się wydajnie | Sprawdź startery pod kątem dimerów starterów lub spinek do włosów, niedopasowań, a czasem obejmujących projekty intronowe. |
| C. Niewłaściwy projekt programu reakcji PCR | 1. Podkłady nie mogą skutecznie wyżarzać2. Niewystarczające uwalnianie polimerazy DNA 3. Długoterminowa aktywność polimerazy DNA w wysokiej temperaturze spadła | 1. Temperatura wyżarzania jest wyższa niż wartość TM podkładu2. Czas wstępnej denaturacji jest zbyt krótki 3. Czas każdego etapu procedury reakcji jest zbyt długi |
| D. Niewystarczające wymieszanie odczynników lub błędy pipetowania | W układzie reakcyjnym miejscowe stężenie składników reakcji PCR jest zbyt wysokie lub nierównomierne, co skutkuje niewykładniczą amplifikacją amplifikacji PCR | |
| E. Długość amplikonu | Długość amplikonu jest zbyt długa, przekracza 300 pz, a wydajność amplifikacji jest niska | Sprawdź, czy długość amplikonu mieści się w przedziale 80-300 pz |
| F. Wpływ odczynników qPCR | Stężenie polimerazy DNA w odczynniku jest niskie lub stężenie jonów w buforze nie jest zoptymalizowane, co powoduje, że aktywność enzymu Taq nie osiąga maksimum | Wyznaczanie wydajności amplifikacji za pomocą krzywej wzorcowej |
2.Zakres wartości Ct
Wartości Ct wahają się od 15-35.Jeśli wartość Ct jest mniejsza niż 15, uważa się, że amplifikacja mieści się w zakresie okresu podstawowego, a próg fluorescencji nie został osiągnięty.W idealnym przypadku istnieje liniowa zależność między wartością Ct a logarytmem początkowej liczby kopii szablonu, czyli krzywą wzorcową.Na podstawie krzywej standardowej, gdy wydajność amplifikacji wynosi 100%, obliczona wartość Ct do ilościowego określenia liczby pojedynczych kopii genu wynosi około 35. Jeśli jest większa niż 35, początkowa liczba kopii matrycy jest teoretycznie mniejsza niż 1, co można uznać za bez znaczenia.
Dla różnych zakresów Ct genu, ze względu na różnicę liczby kopii genu i wydajności amplifikacji w początkowej ilości matrycy, konieczne jest wykonanie krzywej wzorcowej dla genu i obliczenie liniowego zakresu detekcji genu.
3. Czynniki wpływające na wartość Ct
Z zależności między liczbą cykli amplifikacji a ilością produktu: ilość amplifikowanego produktu = ilość początkowej matrycy × (1+En) liczba cykli widać, że w idealnych warunkach ilość początkowej matrycy i En będzie miała negatywny wpływ na wartość Ct.Różnica w jakości matrycy lub wydajności amplifikacji spowoduje, że wartość Ct będzie za duża lub za mała.
4. Wartość Ct jest za duża lub za mała
Czas postu: 22-02-2023
