Utrata słuchu (HL) jest najczęstszą chorobą związaną z niepełnosprawnością sensoryczną u ludzi.W krajach rozwiniętych około 80% przypadków głuchoty przedjęzykowej u dzieci jest spowodowanych czynnikami genetycznymi.Najczęstsze są defekty pojedynczego genu (jak pokazano na ryc. 1), stwierdzono, że 124 mutacje genów są związane z niesyndromiczną utratą słuchu u ludzi, pozostałe są spowodowane czynnikami środowiskowymi.Implant ślimakowy (urządzenie elektroniczne umieszczane w uchu wewnętrznym, które zapewnia stymulację elektryczną bezpośrednio nerwu słuchowego) jest zdecydowanie najskuteczniejszą opcją leczenia ciężkiego HL, podczas gdy aparat słuchowy (zewnętrzne urządzenie elektroniczne, które przekształca i wzmacnia fale dźwiękowe) może pomóc Pacjentom z umiarkowanym HL.Jednak obecnie nie ma dostępnych leków do leczenia dziedzicznego HL (GHL).W ostatnich latach terapia genowa cieszy się coraz większym zainteresowaniem jako obiecujące podejście do leczenia dysfunkcji ucha wewnętrznego.

Ryc. 1.Dystrybucja typu zmienności związanej z głuchotą.[1]

Niedawno naukowcy z Salk Institute i University of Sheffield opublikowali wynik badań w Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], który ukazał szerokie perspektywy zastosowania terapii genowej in vivo dziedzicznej głuchoty.Uri Manor, adiunkt w Salk Institute i dyrektor Waitt Center for Advanced Biophotonics, powiedział, że urodził się z poważnym ubytkiem słuchu i czuł, że przywrócenie słuchu byłoby wspaniałym darem.Jego poprzednie badania wykazały, że Eps8 jest białkiem regulatorowym aktyny, które wiąże i blokuje aktynę;w ślimakowych komórkach rzęsatych kompleks białkowy utworzony przez Eps8 z MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 i GNAI3 występuje głównie w większości. Końcówki długich stereocilii, które wraz z MYO15A lokalizują BAIAP2L2 na końcach krótszych stereocilii, są wymagane do utrzymania wiązek włosów.Dlatego Eps8 może regulować długość stereocilii komórek rzęsatych, co jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania słuchu;Delecja lub mutacja Eps8 doprowadzi do krótkich stereocilii, które uniemożliwią prawidłową konwersję dźwięku na sygnały elektryczne dla percepcji mózgu, co z kolei prowadzi do głuchoty..W tym samym czasie współpracownik Walter Marcotti, profesor z University of Sheffield, odkrył, że komórki rzęsate nie mogą rozwijać się normalnie pod nieobecność Eps8.W tym badaniu Manor i Marcotti połączyli siły, aby zbadać, czy dodanie Eps8 do komórek rzęskowych stereo może przywrócić ich funkcję, a co za tym idzie, poprawić słuch u myszy.Zespół badawczy wykorzystał wektor wirusa związanego z adenowirusami (AAV) Anc80L65 do dostarczenia sekwencji kodującej zawierającej EPS8 typu dzikiego do ślimaka nowonarodzonych myszy Eps8-/- P1-P2 przez wstrzyknięcie membrany z okrągłym okienkiem;w komórkach rzęsatych ślimaka myszy Funkcja stereocilii została naprawiona przed ich dojrzewaniem;a efekt naprawy scharakteryzowano za pomocą technologii obrazowania i pomiaru stereocilii.Wyniki pokazały, że Eps8 zwiększył długość stereocilii i przywrócił funkcję komórek rzęsatych w komórkach o niskiej częstotliwości.Odkryli również, że z biegiem czasu komórki wydawały się tracić zdolność do ratowania przez tę terapię genową.Sugeruje to, że leczenie to może wymagać podania in utero, ponieważ komórki rzęsate Eps8-/- mogły dojrzeć lub nagromadzić uszkodzenia nie do naprawienia po urodzeniu myszy.„Eps8 to białko o wielu różnych funkcjach i wciąż jest wiele do odkrycia” – powiedział Manor.Przyszłe badania obejmą zbadanie wpływu terapii genowej Eps8 na przywracanie słuchu na różnych etapach rozwoju oraz sprawdzenie, czy możliwe jest przedłużenie możliwości leczenia.Przypadkowo w listopadzie 2020 r. profesor KarenB Avraham z Uniwersytetu w Tel Awiwie w Izraelu opublikował swoje wyniki w czasopiśmie EMBO Molecular Medicine [3], wykorzystując innowacyjną technologię terapii genowej do stworzenia nieszkodliwego syntetycznego wirusa związanego z adenowirusami AAV9-PHP.B, Defekt genu w komórkach rzęsatych myszy Syne4-/- został naprawiony przez wstrzyknięcie wirusa niosącego sekwencję kodującą Syne4 do ucha wewnętrznego myszy, umożliwiając mu wejście do komórek rzęsatych i uwolnienie przenoszonego materiału genetycznego, umożliwiając im dojrzewanie i normalne funkcjonowanie (jak na ryc. 2).

Ryc.2.Schematyczne przedstawienie anatomii ucha wewnętrznego, z naciskiem na narząd Cortiego i funkcję komórkową nespryny-4.

Można zauważyć, że zastosowanie terapii genowej do osiągnięcia celu leczenia chorób dziedzicznych na poziomie genów poprzez wstawianie, usuwanie lub korygowanie wszelkich zmutowanych genów w celu leczenia (czyli kontrolowania zmian genetycznych w chorobie) ma wysoki efekt kliniczny.perspektywy zastosowania.Obecne metody terapii genowej głuchoty z niedoborem genetycznym można podzielić na następujące kategorie:

wymiana genów

Zastąpienie genu jest prawdopodobnie najbardziej „prostą” formą terapii genowej, opartą na identyfikacji i zastąpieniu wadliwego genu normalną lub dziką kopią genu.Pierwsze udane badanie terapii genowej ucha wewnętrznego w przypadku utraty słuchu spowodowanej delecją genu pęcherzykowego transportera glutaminianu 3 (VGLUT3);Dostarczenie egzogennej nadekspresji VGLUT3 za pośrednictwem AAV1 w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego (IHC) może skutkować trwałym powrotem słuchu, częściowym przywróceniem morfologii synaps wstęgowych i odpowiedziami konwulsyjnymi [4].Jednak w przykładach obejmujących dwa zamienniki genów dostarczone przez AAV, opisane we wstępie powyżej, należy zauważyć, że modele mysie stosowane w niektórych typach dziedzicznych zaburzeń utraty słuchu z delecją genów różnią się czasowo od ludzi, a u myszy P1 ucho wewnętrzne znajduje się na dojrzałym etapie rozwoju.Natomiast ludzie rodzą się z dojrzałym uchem wewnętrznym.Ta różnica uniemożliwia zastosowanie wyników uzyskanych na myszach do leczenia dziedzicznych zaburzeń głuchoty u ludzi, chyba że do dojrzałych uszu myszy zostanie dostarczona terapia genowa.

Edycja genów: CRISPR/Cas9

W porównaniu z „wymianą genów”, rozwój technologii edycji genów przyniósł początek leczenia chorób genetycznych od podstaw.Co ważne, metoda edycji genów rekompensuje wady tradycyjnych metod terapii genowej z nadekspresją, które nie są odpowiednie dla dominujących dziedzicznych chorób głuchoty, oraz problem polegający na tym, że metoda nadekspresji nie trwa długo.Po tym, jak chińscy naukowcy specjalnie wyeliminowali zmutowany allel Myo6C442Y u myszy Myo6WT/C442Y przy użyciu systemu edycji genów AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2 iw ciągu 5 miesięcy od nokautu, myszy przywrócono funkcję słuchową modelu;Jednocześnie zaobserwowano również poprawę przeżywalności komórek rzęsatych w uchu wewnętrznym, regularność kształtu rzęsek oraz poprawę wskaźników elektrofizjologicznych [5].Jest to pierwsze na świecie badanie wykorzystujące technologię CRISPR/Cas9 do leczenia dziedzicznej głuchoty spowodowanej mutacją genu Myo6 i stanowi ważny postęp w badaniach nad technologią edycji genów w leczeniu dziedzicznej głuchoty.Kliniczne tłumaczenie leczenia zapewnia solidną podstawę naukową.

Metody dostarczania terapii genowej

Aby terapia genowa była skuteczna, cząsteczki nagiego DNA nie mogą skutecznie penetrować komórek ze względu na swoją hydrofilowość i ujemny ładunek grup fosforanowych, a aby zapewnić integralność uzupełnianych cząsteczek kwasu nukleinowego, należy wybrać bezpieczną i skuteczną metodę.Uzupełnione DNA jest dostarczane do docelowej komórki lub tkanki.AAV jest szeroko stosowany jako nośnik dostarczający do leczenia chorób ze względu na jego silne działanie zakaźne, niską immunogenność i szeroki tropizm do różnych typów tkanek.Obecnie wiele prac badawczych określiło tropizm różnych podtypów AAV w stosunku do różnych typów komórek w ślimaku myszy.Wykorzystując charakterystykę dostarczania AAV w połączeniu z promotorami specyficznymi dla komórki, można uzyskać ekspresję specyficzną dla komórki, co może zmniejszyć efekty poza celem.Ponadto, jako alternatywę dla tradycyjnych wektorów AAV, stale opracowywane są nowe syntetyczne wektory AAV, które wykazują doskonałą zdolność transdukcji w uchu wewnętrznym, z których AAV2/Anc80L65 jest najczęściej stosowany.Niewirusowe metody dostarczania można dalej podzielić na metody fizyczne (mikroiniekcja i elektroporacja) oraz metody chemiczne (nanocząsteczki na bazie lipidów, polimerów i złota).Oba podejścia były stosowane w leczeniu dziedzicznych zaburzeń głuchoty i wykazały różne zalety i ograniczenia.Oprócz nośnika dostarczającego do terapii genowej jako nośnika, można zastosować różne podejścia do podawania genów in vivo w oparciu o różne typy komórek docelowych, drogi podawania i skuteczność terapeutyczną.Skomplikowana struktura ucha wewnętrznego utrudnia dotarcie do komórek docelowych, a dystrybucja środków do edycji genomu jest powolna.Błoniasty błędnik znajduje się w obrębie błędnika kostnego kości skroniowej i obejmuje przewód ślimakowy, przewód półkolisty, łagiewkę i balonik.Jego względna izolacja, minimalne krążenie limfatyczne i oddzielenie od krwi przez barierę labiryntu krwi ograniczają skuteczne ogólnoustrojowe dostarczanie leków tylko noworodkom myszy.Aby uzyskać miana wirusa odpowiednie do terapii genowej, konieczne jest bezpośrednie miejscowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do ucha wewnętrznego.Ustalone drogi iniekcji obejmują [6]: (1) błonę okrągłego okienka (RWM), (2) tracheostomię, (3) cochleostomię śródchłonną lub okołolimfatyczną, (4) błonę okrągłego okienka plus fenestrację rurki (CF) (jak na ryc. 3).

Ryc. 3.Dostarczanie terapii genowej do ucha wewnętrznego.

Chociaż poczyniono wiele postępów w terapii genowej, w oparciu o kliniczne cele translacyjne, należy wykonać więcej pracy, zanim terapia genowa stanie się opcją leczenia pierwszego rzutu dla pacjentów z chorobami genetycznymi, zwłaszcza w zakresie opracowywania bezpiecznych i skutecznych wektorów i metody dostarczania.Wierzymy jednak, że w niedalekiej przyszłości tego rodzaju terapie staną się podstawą spersonalizowanej terapii i będą miały niezwykle pozytywny wpływ na życie osób z zaburzeniami genetycznymi i ich rodzin.

Firma Foregene wprowadziła również wysokowydajny zestaw do badań przesiewowych ukierunkowanych genów, który jest szybki i umożliwia przeprowadzanie odwrotnej transkrypcji i reakcji qPCR bez ekstrakcji RNA.

Linki do produktów

Zestaw Cell Direct RT-qPCR — Taqman/SYBR GREEN I

Aby uzyskać więcej informacji o produkcie, prosimy o kontakt:

overseas@foregene.com