Wyjątkową cechą reakcji PCR jest jej duża zdolność amplifikacji i niezwykle wysoka czułość.Aby poprawić wydajność PCR i skuteczność wykrywania, jesteśmy zaangażowani w poprawę zdolności amplifikacji PCR i czułości wykrywania, ale ból głowy jest w trakcie eksperymentu.Często zdarzają się fałszywe alarmy, a bardzo mała ilość zanieczyszczenia krzyżowego próbki lub zanieczyszczenia produktu PCR może spowodować fałszywy alarm w eksperymencie.
Pięć rodzajów zanieczyszczeń produktu PCR
Istnieje wiele przyczyn zanieczyszczenia PCR, które można z grubsza podzielić na następujące kategorie:
Zanieczyszczenie próbki jest spowodowane głównie zanieczyszczeniem pojemnika do pobrania próbki lub gdy próbka jest umieszczana, wycieka z pojemnika z powodu luźnego uszczelnienia lub próbka przylega do zewnętrznej powierzchni pojemnika, co powoduje zanieczyszczenie krzyżowe;Zanieczyszczenie prowadzi do zanieczyszczenia między próbkami;niektóre okazy drobnoustrojów, zwłaszcza wirusy, mogą rozprzestrzeniać się w aerozolach lub tworzyć aerozole, powodując wzajemne skażenie.
Głównym powodem jest to, że podczas przygotowywania odczynników do PCR pistolet do próbek, pojemnik, woda podwójnie destylowana i inne roztwory są zanieczyszczone matrycą kwasu nukleinowego PCR.
W laboratoriach biologii molekularnej i niektórych laboratoriach, które używają sklonowanych plazmidów jako kontroli pozytywnych, powszechny jest również problem zanieczyszczenia sklonowanymi plazmidami.Ponieważ zawartość plazmidu do klonowania w jednostce objętości jest dość wysoka, a proces oczyszczania wymaga więcej narzędzi i odczynników, a plazmid w żywych komórkach jest bardzo prawdopodobnie zanieczyszczony z powodu silnej zdolności wzrostu i reprodukcji żywych komórek.
Zanieczyszczenie amplifikowanych produktów jest najczęstszym problemem związanym z zanieczyszczeniem w reakcjach PCR.Ponieważ ilość kopii produktu PCR jest duża (zwykle 1013 kopii/ml), co znacznie przekracza limit wykrywanej liczby kopii PCR, bardzo mała ilość zanieczyszczenia produktu PCR może powodować fałszywe alarmy.
Zanieczyszczenie aerozolami jest najbardziej prawdopodobną formą zanieczyszczenia produktów PCR, a także najłatwiejszą do przeoczenia.Powstaje w wyniku tarcia powierzchni cieczy o powietrze.Zasadniczo zanieczyszczenie aerozolem może powstać podczas otwierania pokrywy, podczas zasysania próbki lub nawet podczas energicznego wstrząsania probówką reakcyjną.Według obliczeń cząsteczka aerozolu może zawierać 48 000 kopii, więc powodowane przez nią zanieczyszczenia to problem zasługujący na szczególną uwagę.
W szczególności laboratoria badawcze często używają tej samej pary starterów do testowania określonego genu.Z biegiem czasu w przestrzeni laboratoryjnej pojawi się duża ilość zanieczyszczeń produktami PCR.Kiedy takie zanieczyszczenie już się pojawi, trudno jest je wyeliminować w krótkim czasie.
W przypadku pierwszych trzech rodzajów zanieczyszczeń możemy skutecznie ich uniknąć, jednak zanieczyszczeniom powodowanym przez produkty PCR trudno jest zapobiec, zwłaszcza przy budowie niestandardowych laboratoriów PCR.W procesie PCR, gdy końcówka pipety zasysa i wydmuchuje ciecz, a pokrywa probówki do PCR jest otwarta, tworzy się aerozol.Cząsteczki DNA przenoszone przez aerozol (jeden aerozol może przenosić dziesiątki tysięcy DNA) są trudne do wyeliminowania, ponieważ unoszą się w powietrzu.Po wprowadzeniu kolejnej rundy eksperymentów PCR nieuchronnie wystąpią fałszywe alarmy.
Jak pokazano na poniższym rysunku, kontrola ujemna wzmocniła również odpowiednie pasmo zainteresowania:
Pierwsza część tego zagadnienia dotyczącego zanieczyszczenia PCR i zapobiegania jest przedstawiona tutaj.W następnym numerze znajdziecie drugą część „Zapobieganie zanieczyszczeniu produktów PCR”, więc bądźcie czujni!
Czas postu: 25-07-2017
