Direct PCR to reakcja, w której bezpośrednio wykorzystuje się tkanki zwierzęce lub roślinne do amplifikacji bez ekstrakcji kwasu nukleinowego.Pod wieloma względami bezpośredni PCR działa jak zwykły PCR

Główną różnicą jest niestandardowy bufor używany w bezpośredniej reakcji PCR, próbka może być bezpośrednio poddana reakcji PCR bez ekstrakcji kwasu nukleinowego, ale istnieją odpowiednie wymagania dotyczące tolerancji enzymów i kompatybilności buforu biorącego udział w bezpośredniej reakcji PCR.

Chociaż w powszechnych próbkach jest mniej lub więcej inhibitorów PCR, bezpośredni PCR może nadal zapewnić wiarygodną amplifikację pod działaniem enzymów i buforów.Tradycyjna reakcja PCR wymaga wysokiej jakości kwasu nukleinowego jako matrycy, która może hamować płynny przebieg reakcji PCR, jeśli matryca zawiera białka i inne zanieczyszczenia.Direct PCR to obecnie jedna z bardziej popularnych technologii z zakresu diagnostyki molekularnej.

01 Bezpośredni PCR był pierwotnie stosowany w przypadku zwierząt i roślin

Najwcześniejsze zastosowanie bezpośredniego PCR dotyczy zwierząt i roślin, takich jak krew, tkanki i sierść szczura, kota, kurczaka, królika, owcy, bydła itp., liści i nasion roślin itp., wykorzystywanych do badania genotypowania, transgeniczności, wykrywania plazmidów, analizy nokautu genów, identyfikacji źródła DNA, identyfikacji gatunku, analizy SNP i innych dziedzin.

Pola te mają pewne wspólne cechy, to znaczy zawartość genów docelowych jest stosunkowo wysoka, a ekstrakcja kwasu nukleinowego jest kłopotliwa, więc bezpośredni PCR może nie tylko zaoszczędzić czas i mieć niewielki wpływ na wyniki, ale także obniżyć koszty.

Bezpośredni PCR stosowany do wykrywania patogenów to kwestia ostatnich lat, niektórzy producenci odczynników PCR poczynili wiele wysiłków w tym kierunku, wprowadzając innowacje.Szczególnie w tej epidemii COVID-19 na rynku pojawiło się wiele takich produktów wykrywających, takich jak zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) opracowany i opracowany przez firmę Foregene, która wykorzystuje technologię Real-time RT PCR (rRT-PCR) do jakościowego wykrywania kwasów nukleinowych SARS-CoV-2 w próbkach wymazów z jamy nosowo-gardłowej lub ustno-gardłowej.

Foregene jest jedną z firm stosujących technologię Direct PCR do wykrywania prawidłowych ORF1ab, N, E iwariant linii kwasów nukleinowych w ludzkich próbkach wymazów z jamy nosowo-gardłowej lub jamy ustnej i gardła, takich jak linia SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), linia B.1.351 (ZA), linia B.1.617 (IND) i linia P.1 (BR).

02  Odczynniki potrzebne do bezpośredniego PCR

Próbka lizatu

Lizat próbki można skonfigurować samodzielnie lub zakupić.Różnica w składzie różnych marek lizatu spowoduje, że zdolność lizy będzie inna, a wtedy czas lizy będzie nieco inny.Na przykład, do przygotowania próbek tkanek zwierzęcych ogólnie zaleca się lizę trwającą 30 minut lub całą noc, a czas trwania roztworu do lizy dla wirusów wynosi od 3 do 10 minut.

Master Mix PCR

Zaleca się stosowanie polimerazy DNA typu hot-start w celu zwiększenia swoistej amplifikacji i zwiększenia zdolności amplifikacji.Rdzeniem bezpośredniego PCR jest wysoce tolerancyjna polimeraza.

Eliminacja lub hamowanie składników w próbce, które wpływają na amplifikację DNA

Po przetworzeniu próbki z lizatem uwolnione zostaną białka, lipidy i inne szczątki komórkowe, które zahamują reakcję PCR.W związku z tym bezpośredni PCR wymaga dodania odpowiedniego usuwania lub inhibitorów w celu zmniejszenia wpływu tych czynników.

03  Zbiór pięciu punktów wiedzy o bezpośrednim PCR

Po pierwsze, technologia Direct PCR to bezpośrednia technologia PCR dla różnych próbek biologicznych.W tych warunkach technicznych nie ma potrzeby oddzielania i ekstrakcji kwasu nukleinowego, bezpośredniego użycia próbki tkanki jako obiektu i dodania docelowego genu startery mają przeprowadzić reakcję PCR.

Po drugie, technologia Direct PCR to nie tylko tradycyjna technologia amplifikacji matrycy DNA, ale obejmuje również PCR z odwrotną transkrypcją matrycy RNA.

Po trzecie, technologia Direct PCR nie tylko bezpośrednio przeprowadza rutynowe jakościowe reakcje PCR na próbkach tkanek, ale obejmuje również reakcje qPCR w czasie rzeczywistym, co wymaga, aby system reakcyjny miał silną zdolność przeciwdziałania interferencji fluorescencji tła, a endogenna fluorescencja tłumiła zdolność antagonistyczną.

Po czwarte, próbki docelowe dla technologii Direct PCR wymagają jedynie uwolnienia matryc kwasu nukleinowego i nie usuwają białek, polisacharydów, jonów soli itp., które zakłócają reakcję PCR.Co wymaga, aby polimeraza kwasu nukleinowego i mieszanina PCR w systemie reakcyjnym miały doskonałą odporność i zdolności adaptacyjne, aby zapewnić aktywność enzymu i dokładność replikacji w złożonych warunkach.

Po piąte, próbka tkanki, do której kierowana jest technologia Direct PCR bez żadnego wzbogacania kwasem nukleinowym, a ilość matrycy jest bardzo mała, co wymaga wyjątkowo wysokiej czułości i wydajności amplifikacji układu reakcyjnego.