Uważam, że każdy zawsze napotka takie lub takie problemy podczas przeprowadzania reakcji PCR, ale większość z nich można podzielić na dwa główne problemy:

Zbyt mała amplifikacja matrycy genu (amplifikacja);
Zbyt duża amplifikacja genu niedocelowego.
Stosowanie dodatków jest jedną z powszechnych strategii rozwiązywania tych problemów.Zwykle rola dodatków ma dwa aspekty:
struktura drugorzędowagenów (struktura drugorzędowa);
Zmniejsz niespecyficzne torowanie.
Dzisiaj redaktor pokrótce przedstawi Ci powszechnie stosowane dodatki w reakcjach PCR i ich funkcje.
Dodatki redukujące strukturę drugorzędową
sulfotlenek(DMSO)
próbki genówz wysoką zawartością GC.Jednak DMSO również znacznie zmniejsza aktywność polimerazy Taq.Dlatego każdy musi zrównoważyć dostępność szablonu i aktywność polimerazy.Redaktor sugeruje, że możesz wypróbować różne stężenia DSMO, na przykład od 2% do 10%, aby znaleźć stężenie, które pasuje do twojego eksperymentu.
Detergenty niejonowe
Detergenty niejonowe, takie jak 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 lub NP-40, zwykle redukują strukturę drugorzędową DNA.Chociaż może to zwiększyć amplifikację genu matrycy, spowoduje to również problemy z niespecyficzną amplifikacją.Tak więc te dodatki działają dobrze w reakcjach PCR o niskiej wydajności bez zanieczyszczeń, ale nie tak dobrze w przypadku względnie zanieczyszczonych reakcji PRC.Inną zaletą detergentów niejonowych jest zmniejszenie zanieczyszczenia SDS.Zwykle podczas procesu ekstrakcji DNA SDS zostanie doprowadzony do etapu PCR, co znacznie hamuje aktywność polimerazy.Dlatego dodanie 0,5% Tween-20 lub Tween-40 do reakcji może zneutralizować negatywne skutki SDS.
Betaina_
Betaina może poprawić amplifikację DNA poprzez zmniejszenie tworzenia się struktury drugorzędowej i jest ogólnie „tajemniczym” dodatkiem do komercyjnych zestawów PCR.Jeśli chcesz stosować betainę, powinieneś dodać betainę lub monohydrat betainy (Betaine lub Betaine monohydrat), ale nie chlorowodorek betainy (Betaine HCl), doprowadź do końcowego stężenia 1-1,7M.Betaina może również pomóc poprawić specyficzność, ponieważ eliminuje zależność składu par zasad od topnienia DNA/denaturacji DNA.
Dodatki redukujące niespecyficzne torowanie
Formamid
Formamid jest powszechnie stosowanym organicznym dodatkiem do PCR.Może łączyć się z głównym rowkiem i mniejszym rowkiem w DNA, zmniejszając w ten sposób stabilność podwójnej helisy głównego DNA i obniżając temperaturę topnienia DNA.Stężenie formamidu stosowanego w doświadczeniach PCR wynosi zazwyczaj 1%-5%.
tetrametylchlorek amonu( TMAC)
Chlorek tetrametyloamoniowy może zwiększać specyficzność hybrydyzacji (specyficzność hybrydyzacji) i zwiększać temperaturę topnienia DNA.Zatem TMAC może usuwać niespecyficzne primowanie i zmniejszać nieprawidłowe wiązanie DNA i RNA.Jeśli użyjeszzdegenerowane podkładyw reakcji PCR należy pamiętać o dodaniu TMAC, który jest powszechnie stosowany w stężeniu 15-100mM.
Inne popularne dodatki
Oprócz dwóch kategorii dodatków wymienionych powyżej, istnieje wiele powszechnych dodatków w reakcjach PCR, chociaż mają różne funkcje, są również bardzo ważne.
jon magnezu
Jon magnezu jest niezbędnym kofaktorem (kofaktorem) polimerazy, to znaczy bez jonu magnezu polimeraza jest nieaktywna.Jednak zbyt duża ilość jonów magnezu może również wpływać na wydajność polimerazy.Stężenie jonów magnezu w każdej reakcji PCR będzie się różnić.Czynniki chelatujące (takie jak EDTA czy cytrynian), stężenie dNTP i białek wpływają na stężenie jonów magnezu.Tak więc, jeśli masz problemy z eksperymentem PCR, możesz spróbować zmienić różne stężenia jonów magnezu, na przykład z 1,0 na 4,0 mM, w odstępach 0,5–1 mM.
Warto zauważyć, że wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania mogą prowadzić do rozwarstwienia stężenia roztworu chlorku magnezu.Dlatego należy go całkowicie rozpuścić przed każdym użyciem i dobrze wymieszać przed użyciem.
Albumina surowicy bydlęcej(Albumina wołowa, BSA)
W eksperymentach chemii molekularnej albumina surowicy bydlęcej jest bardzo powszechnym dodatkiem, zwłaszcza w trawieniu enzymami restrykcyjnymi i eksperymentach PCR.W reakcjach PCR BSA jest pomocny w redukcji zanieczyszczeń, takich jak związki fenolowe.Mówi się również, że może zmniejszać przyczepność reagentów do ścianki probówki.W reakcji PCR zwykle stężenie dodanego BSA może osiągnąć 0,8 mg/ml.
 
Produkty powiązane:
Bohater PCR(z barwnikiem)
Bohater PCR