Autorzy: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Jednostka: Szpital Jiaozhou, Szpital Dongfang Powiązany z Uniwersytetem Tongji

Obecnie głównym rodzajem próbki do wykrywania kwasów nukleinowych patogenów układu oddechowego jest wymaz z gardła.Istnieje wiele rodzajów powszechnie stosowanych roztworów do konserwacji próbek, z których wszystkie należy schłodzić lub zamrozić na czas transportu i przechowywania;Trudno jest kontrolować cały proces niskiej temperatury podczas procesu pobierania i transportu, a także trudno jest zapewnić kontrolę jakości przed badaniem próbek^[1-2].

RNaza (RNaza) jest endonukleazą, która hydrolizuje RNA, głównie zrywając wiązania fosfodiestrowe między nukleotydami.Cząsteczka RNazy jest bardzo stabilna, w strukturze występują wiązania dwusiarczkowe, a jej działanie nie wymaga obecności kationów dwuwartościowych, przez co RNaza nie ulega łatwo denaturacji i łatwo ulega renaturacji nawet pod wpływem wysokiej temperatury lub użycia denaturantów.RNazy dzielą się na endogenne i egzogenne.Endogenne RNazy mogą być uwalniane w tym samym czasie, gdy komórki ulegają pęknięciu.Dlatego wyeliminowanie roli endogennych RNaz jest bardzo krytycznym krokiem w procesie ekstrakcji RNA.Egzogenne RNazy są szeroko rozpowszechnione.RNazy występują w powietrzu, ludzkiej skórze, włosach i ślinie, co jest ważną przyczyną łatwej degradacji RNA^[3].

Zapytanie o dane

CANS-CL02-A009 „Zastosowanie wytycznych akredytacji jakości i kompetencji laboratoriów medycznych w zakresie diagnostyki molekularnej” w wymaganiach technicznych proponuje sformułowanie odpowiednich standardów jakości wody zgodnie z wnioskiem;Jednorazowe hermetyczne pojemniki:

RNazy/Klasyfikacja

(1) RNaza A

Rybonukleaza A (RNaza A), pochodząca z trzustki bydlęcej, jest endorybonukleazą, która może specyficznie atakować koniec 3' reszt pirymidynowych w RNA, tnąc cytozynę lub uracyl utworzone przez sąsiednie nukleotydy.Wiązanie fosfodiestrowe, końcowym produktem reakcji jest 3' nukleotyd pirymidynowy i oligonukleotyd z 3' nukleotydem pirymidynowym na końcu.

(2) RNaza T1

Rybonukleaza T1 (RNaza T1) pochodzi z Aspergillus orjzae, działa specyficznie na 3'-końcowy fosforan guaniny, a miejsce cięcia znajduje się pomiędzy 3' fosforanem guaniny a 5' hydroksylem sąsiednich nukleotydów.Końcowym produktem reakcji jest kwas 3′guanylowy i fragmenty oligonukleotydów z kwasem 3′guanylowym na końcu.

(3) RNaza H

Rybonukleazę H (RNazę H) po raz pierwszy odkryto w tkance grasicy cielęcej, a jej kodujący gen sklonowano w Escherichia coli.Może specyficznie degradować nici DNA: RNA w hybrydowych dupleksach RNA, w wyniku czego powstają oligonukleotydy i mononukleotydy z końcami 3′-OH i 5′-monofosforanowymi, nie może degradować jedno- lub dwuniciowego DNA lub RNA.

RNaza

Funkcja i zastosowanie

Rybonukleaza może katalizować degradację kwasu rybonukleinowego (RNA) i może być syntetyzowana sztucznie.Maść leczniczą stosuje się miejscowo w leczeniu urazów i bólu stawów.Według doniesień rybonukleaza może zmieniać metabolizm komórki gospodarza, hamować syntezę wirusa, hamować proliferację wirusa grypy in vitro oraz hamować tworzenie wirusa krowianki i wirusa opryszczki w zarodkach kurzych.Kliniczne zastosowanie rybonukleazy, codzienne wstrzyknięcie domięśniowe 180 mg, korzystne w leczeniu epidemicznego zapalenia mózgu, rybonukleaza może katalizować degradację kwasu rybonukleinowego (RNA) i może być teraz sztucznie syntetyzowana.Maść leczniczą stosuje się miejscowo w leczeniu urazów i bólu stawów.Według doniesień rybonukleaza może zmieniać metabolizm komórki gospodarza, hamować syntezę wirusa, hamować proliferację wirusa grypy in vitro oraz hamować tworzenie wirusa krowianki i wirusa opryszczki w zarodkach kurzych.Kliniczne zastosowanie rybonukleazy w dziennym wstrzyknięciu domięśniowym w dawce 180 mg jest korzystne w leczeniu epidemicznego zapalenia mózgu.

RNaza

Definicja inhibitora

Definicja jednostki inhibitora RNazy: Ilość enzymu wymagana do zahamowania 50% aktywności 5 ng RNazy A to jedna jednostka.

Jak działają inhibitory RNaz

Izotiocyjanian guanidyny:

Izotiocyjanian guanidyny jest związkiem organicznym o wzorze cząsteczkowym C2H6N4S.Stosowany głównie w medycynie biologicznej, odczynnikach chemicznych itp. Izotiocyjanian guanidyny jest środkiem lizującym białka i jest często stosowany jako główny składnik roztworu do lizy w molekularnych odczynnikach diagnostycznych.Może lizować tkankę, niszczyć strukturę komórkową i dysocjować kwas nukleinowy z nukleoproteiny i ma silną denaturację RNazy.Jest to obecnie najskuteczniejszy inhibitor RNazy.

TRIzol to nowy odczynnik do ekstrakcji całkowitego RNA, który umożliwia bezpośrednią ekstrakcję całkowitego RNA z komórek lub tkanek.Zawiera substancje, takie jak izotiocyjanian fenolu i guanidyny, które mogą szybko rozbijać komórki i hamować nukleazy uwalniane przez komórki.

(Jednakże izotiocyjanian guanidyny jest niebezpieczny dla zdrowia naukowców laboratoryjnych).

RNasin:

Kwaśna glikoproteina ekstrahowana z wątroby szczura lub ludzkiej blastodermy.Rnazyna jest niekonkurencyjnym inhibitorem RNazy, który może wiązać się z różnymi RNazami w celu ich inaktywacji.

(Więcej szczegółów: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hwysoka temperatura:

Wysoka temperatura jest również powszechnym sposobem denaturacji białek.

Pirowęglan dietylu (DEPC):

DEPC jest silnym, ale niekompletnym inhibitorem RNazy, który może hamować aktywność RNazy, łącząc się z pierścieniem aminokwasu imidazolu grupy aktywnej RNazy w celu denaturacji białek.

Kompleks rybonukleozydowy wanadylu:

Kompleks tworzony przez jony tlenku wanadu i nukleozydy, który wiąże się z RNazą w postaci substancji przejściowych, które mogą prawie całkowicie hamować aktywność RNazy

Inny:

SDS, mocznik, ziemia okrzemkowa itp. również mają pewien wpływ hamujący na RNazę.

Recenzje ekspertów

Li Yujie główny technik

Dyrektor Oddziału Laboratorium, Szpital Jiaozhou, Szpital Dongfang Powiązany z Uniwersytetem Tongji

Aby zapobiec biodegradacji egzogennej RNazy, podczas procesu ekstrakcji RNA należy często nosić i wymieniać maski, rękawiczki i nakrycia głowy.Wszystkie naczynia szklane muszą być pieczone w suszarce w temperaturze 200°C przez ponad 2 godziny.Materiały używane do pieczenia, takie jak tworzywa sztuczne, należy poddać działaniu wody DEPC, a następnie przemyć wodą destylowaną.Odczynniki lub urządzenia stosowane do ekstrakcji, konserwacji i identyfikacji RNA powinny być przeznaczone do RNA i należy stworzyć niezależny obszar działania RNA.

Bibliografia:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bakterie i wirusy w nosogardzieli bezpośrednio przed wystąpieniem ostrych infekcji dolnych dróg oddechowych u rdzennych dzieci z Australii [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] Oddział Kontroli Zakażeń Szpitalnych Chińskiego Stowarzyszenia Medycyny Prewencyjnej.Wytyczne dotyczące pobierania i kontroli klinicznych próbek drobnoustrojów [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] „Test kliniczny Dziesięć tysięcy Dlaczego objętość testu biologii molekularnej”