Przewodnik po analizie problemu

Poniższa analiza problemów, które możesz napotkać wSuma roślinRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

Kolumna wirująca jest zatkana

Zablokowanie kolumny wirówkowej spowoduje zmniejszenie wydajności RNA lub wręcz uniemożliwienie jego oczyszczenia w celu uzyskania RNA, a jakość otrzymanego RNA będzie niska.

Analiza wspólnej przyczyny:

1. Próbka nie jest całkowicie rozbita.

Niepełna fragmentacja próbki może zablokować kolumnę czyszczącą DNA, co może również wpłynąć na wydajność i jakość RNA.Zalecamy, aby podczas rozdrabniania próbek szybko rozdrobnić wystarczającą ilość ciekłego azotu, aby w jak największym stopniu rozbić tkanki, takie jak ściany komórkowe i błony komórkowe próbek.W przypadku roślinnych próbek polisacharydów polifenolowych zalecamy użycie zestawu Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

2. Zaaspirować supernatant wyizolowany z kolumny czyszczącej DNA, zaaspirować ewentualne osady komórkowe.

Odessany osad komórek może zatkać kolumnę zawierającą tylko RNA podczas procedur adsorpcji RNA (patrz krok 5 procedury, krok 6 procedury polisacharydów i polifenoli).Zalecamy zachowanie ostrożności podczas odsysania tego supernatantu, aby uniknąć zassania resztek komórek.

3. Początkowa ilość próbki jest zbyt duża.

Nadmierne użycie próbki spowoduje niepełną fragmentację próbki lub niepełną lizę komórek przez bufor PRL1 lub bufor PSL1, co spowoduje zatkanie kolumny oczyszczającej podczas operacji oczyszczania.Plant Total RNA Isolation Kit ma początkowe maksimum 50 mg na pojedyncze oczyszczanie operowanej próbki.W przypadku roślinnych próbek polisacharydów polifenolowych zalecamy wypróbowanie zestawu Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

4. Temperatura wirówki jest zbyt niska.

Izolacja i oczyszczanie całego RNA, z wyjątkiem rozrywania próbki tkanki ciekłym azotem, wszystkie etapy przeprowadza się w temperaturze pokojowej (20-25°C).Niektóre wirówki niskotemperaturowe mają temperaturę poniżej 20°C, co może powodować blokadę w kolumnie czyszczącej DNA i/lub kolumnie zawierającej tylko RNA.Jeśli tak się stanie, ustaw temperaturę wirówki na 20–25 °C i podgrzej wstępnie mieszaninę lizującą i/lub supernatant rozdzielający z dodatkiem etanolu do 37 °C.

Brak ekstrakcji RNA lub wydajność RNA jest niska

Zwykle na skuteczność odzysku wpływa wiele czynników, takich jak: zawartość RNA w próbce, sposób działania, objętość elucji itp.

Analiza typowych przyczyn, jak poniżej:

1. Podczas operacji wykonano łaźnię lodową lub wirowanie w niskiej temperaturze (4°C).

Sugestia: Pracować w temperaturze pokojowej (15-25°C) przez cały proces, nie wykonywać kąpieli lodowej i wirowania w niskiej temperaturze.

       2.RNA uległ degradacji z powodu niewłaściwej konserwacji próbki lub długotrwałej konserwacji próbki.

Zalecenie: Świeżo pobrane próbki należy szybko zamrozić w ciekłym azocie, a następnie przechowywać przez długi czas w temperaturze -80°C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek;lub natychmiast zanurz próbki w roztworze stabilizatora RNA RNAlater (próbki zwierzęce).

       3.Niewystarczająca fragmentacja próbki i liza prowadzą do zablokowania kolumny oczyszczającej.

Sugestia: Podczas rozdrabniania tkanki upewnij się, że tkanka jest wystarczająco zmielona i szybko przenieś ją do wcześniej przygotowanego buforu Buffer PSL1 (upewnij się, że dodano odpowiednią proporcję β-ME, patrz krok 1 procedury).

4. Eluent został dodany nieprawidłowo.

Sugestia: Upewnij się, że ddH₂O wkrapla się na środek membrany kolumny oczyszczającej.

5. Do buforu Buffer PSL2 lub Buffer PRW2 nie dodano właściwej objętości etanolu absolutnego.

Sugestia: Postępuj zgodnie z instrukcjami, dodaj odpowiednią objętość etanolu absolutnego do buforów Buffer PSL2 i Buffer PRW2 i dobrze wymieszaj przed użyciem zestawu.

6. Ilość próbki tkanki jest niewłaściwa.

Sugestia: Użyj 50 mg tkanki na 500 μl buforu Buffer PSL1.Użycie zbyt dużej ilości tkanki zmniejszy ilość ekstrahowanego RNA, a także zmniejszy się czystość otrzymanego RNA.Zdecydowanie zalecamy, aby początkowa dawka próbki nie przekraczała 50 mg na operację ekstrakcji RNA.

7. Niewłaściwa objętość elucji lub niepełna elucja.

Sugestia: Objętość eluentu kolumny oczyszczającej wynosi 50-200 μl;jeśli efekt elucji nie jest zadowalający, zaleca się wydłużenie czasu w temperaturze pokojowej po dodaniu podgrzanego ddH wolnego od RNaz₂O, np. 5-10 min.

8. Kolumna oczyszczająca zawiera pozostałości etanolu po przemyciu buforem PRW2.

   Sugestia: Jeśli pusta probówka jest wirowana przez 1 min, a po przepłukaniu buforem PRW2 wciąż pozostaje etanol, można wydłużyć czas wirowania pustej probówki do 2 min lub umieścić kolumnę oczyszczającą w temperaturze pokojowej na 5 min, aby całkowicie usunąć pozostały etanol.

9.Zestaw został użyty nieprawidłowo.

   Sugestia: W przypadku roślinnych próbek polisacharydów polifenolowych użycie typowych zestawów, takich jak Plant Total RNA Isolation Kit, może nie być w stanie uzyskać idealnych próbek RNA.Zalecamy użycie zestawu Plant Total RNA IsolationKit Plus, który jest specjalnie zaprojektowany do próbek roślinnych polisacharydów polifenolowych.Zestaw opracowany specjalnie do ekstrakcji RNA z polifenoli i polisacharydów z próbek roślinnych.

Wartość OD260/OD280 jest niska

Elucja RNA za pomocą ddH₂O i używany do odczytów spektrofotometru daje niskie wartości OD260/OD280.Zalecamy stosowanie 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (zamiast ddH wolnego od RNaz₂O w celu elucji RNA) w celu uzyskania względnie prawidłowych wartości OD260/OD280, patrz „Oznaczenia stężenia i oczyszczania RNA” na stronie 19.

Oczyszczony RNA ulega degradacji

Jakość oczyszczonego RNA jest związana z takimi czynnikami, jak konserwacja próbki, zanieczyszczenie RNazą i manipulacja.

Analiza najczęstszych przyczyn:

1. Próbki tkanek nie były przechowywane w odpowiednim czasie po pobraniu.

    Zalecenie: Jeśli próbki tkanek nie zostaną wykorzystane w czasie po pobraniu, należy natychmiast przechowywać je w ciekłym azocie w niskiej temperaturze lub przenieść je do -80°C w celu długotrwałego przechowywania po szybkim zamrożeniu w ciekłym azocie lub natychmiast zanurzyć próbki w Roztwór stabilizatora RNA RNAlater (próbki zwierzęce).Do ekstrakcji RNA spróbuj użyć świeżo pobranych próbek tkanek.

2. Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie próbek tkanek.

   Sugestia: Podczas przechowywania próbek tkanek najlepiej jest pociąć je na małe kawałki w celu konserwacji i wyjąć część z nich podczas ich używania, aby uniknąć degradacji RNA spowodowanej wielokrotnym zamrażaniem i rozmrażaniem próbek.

3. RNaza jest wprowadzana na salę operacyjną lub nie noszone rękawiczki jednorazowe, maseczki itp.

   Sugestia: Eksperymenty z ekstrakcją RNA najlepiej wykonywać w oddzielnych operacjach RNA, a stół laboratoryjny powinien być wyczyszczony przed eksperymentem, a podczas eksperymentu należy nosić jednorazowe rękawiczki i maski, aby w największym stopniu uniknąć degradacji RNA spowodowanej wprowadzeniem RNazy.

4. Odczynnik jest zanieczyszczony RNazą podczas użycia.

   Sugestia: Zastąp nową serią zestawów do ekstrakcji całkowitego RNA roślinnego do powiązanych eksperymentów.

5. Probówki wirówkowe i końcówki pipet używane do manipulacji RNA są zanieczyszczone RNazą.

Sugestia: Upewnij się, że probówki wirówkowe, końcówki do pipet, pipety itp. używane do ekstrakcji RNA są wolne od RNaz.

Podręczniki:

Instrukcja obsługi zestawu do izolacji całkowitego RNA roślin