Tradycyjne odwrotne transkryptazy nie tolerują wysokich temperatur (optymalna temperatura dla aktywności MMLV to 37-50°C, a AMV to 42-60°C).Bardziej złożone wirusowe RNA nie może być skutecznie poddawane odwrotnej transkrypcji do cDNA w niskich temperaturach, co skutkuje skutecznością wykrywania.Tradycyjny RT-qPCR na ogół wymaga udziału dwóch kluczowych enzymów (odwrotnej transkryptazy i polimerazy DNA), co uniemożliwia uproszczenie działania układu reakcyjnego i obniżenie kosztów.Tutaj przedstawimy dwie odwrotne transkryptazy odporne na wysoką temperaturę, TtH i RevTaq.Te dwa enzymy pełnią również funkcję polimerazy DNA, dlatego nazywane są enzymami dwufunkcyjnymi.

Polimeraza DNA TtH

Na pewno słyszałeś o TtH, który pochodzi od termofilnej bakterii Thermus thermophilus HB8.W obecności dwuwartościowych kationów, takich jak Mg2+, wykazuje aktywność polimerazy DNA.Jest szeroko stosowany w reakcjach PCR, takich jak enzym Taq, ale ma wyższą odporność na ciepło niż enzym Taq, więc ma również lepszy wpływ na PCR z matrycami o wysokiej zawartości GC.

Enzym ten w zasadzie nie wykazuje aktywności egzonukleazy 3′→5′ i egzonukleazy 5′→3′, więc może być również stosowany do sekwencjonowania dideoksy.

· Ten enzym ma aktywność RTazy.W obecności Mn2+ aktywność RTazy będzie zwiększona.Wykorzystując tę ​​cechę, można go wykorzystać do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji i reakcji PCR w tej samej probówce, czyli jednoetapowego RT-PCR.Jednak w obecności Mn2+ dokładność RT-PCR nie jest wysoka.Aktywność RT nie ma nic wspólnego z aktywnością rnaazy H.

· Zwiększona aktywność polimerazy Tth-DNA (pH9, optymalnie +55℃～+70℃, maksymalnie +95℃) przezwycięża problemy spowodowane drugorzędową strukturą RNA.Otrzymany cDNA można zamplifikować metodą PCR z użyciem tego samego enzymu w obecności jonów Mg2+.

· Zdolność polimerazy Tth-DNA do przeprowadzania odwrotnej transkrypcji i amplifikacji DNA w wysokich temperaturach sprawia, że ​​enzym ten jest przydatny do ilościowego RT-PCR, klonowania i analizy ekspresji genów komórkowego i wirusowego RNA.
· Polimeraza Tth-DNA jest używana w RT-PCR do amplifikacji RNA do 1 kb.

Cechy i zalety

T-ta polimeraza DNA:

• Zapewnienie zoptymalizowanej wielkości produktu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), co najmniej 1000 bp w reakcji RT-PCR

• Zaakceptuj zmodyfikowany trifosforan dezoksyrybonukleozydu jako substrat

• Niezwiązany z aktywnością RNazy H

• Ma wysoką stabilność termiczną, aby przezwyciężyć problemy, zwykle związane z wysoką strukturą drugorzędową obecną w RNA

RevTaq RT-PCR polimeraza DNA

Termoodporna polimeraza DNA o aktywności odwrotnej transkryptazy

RevTaq-RT-PCR-DNA polimeraza to zmodyfikowany, wysoce odporny na ciepło, dwufunkcyjny enzym z aktywnością odwrotnej transkryptazy i polimerazy DNA uzyskany w drodze ukierunkowanej i sztucznej ewolucji.

· Okres półtrwania polimerazy DNA RevTaq RT-PCR w temperaturze 95°C jest dłuższy niż 40 minut.

· Polimeraza DNA RevTaq RT-PCR umożliwia odwrotną transkrypcję w wysokiej temperaturze bezpośrednio z matrycy RNA, a etap odwrotnej transkrypcji można powtarzać wiele razy, aby wygenerować więcej matryc cDNA.

· Polimeraza DNA RevTaq RT-PCR umożliwia „zero-etapową” RT-PCR (bez izotermicznego etapu odwrotnej transkrypcji), ponieważ w etapie cyklicznego wydłużania PCR odwrotna transkrypcja i amplifikacja DNA zachodzą jednocześnie.Sprzyja to również reakcji odwrotnej transkrypcji w wysokich temperaturach, minimalizując w ten sposób problemy napotykane podczas topienia silnej drugorzędowej struktury RNA w wysokich temperaturach.

· Ze względu na formułę gorącego startu opartą na aptamerach, polimeraza DNA RevTaq RT-PCR daje lepsze wyniki, gdy temperatura hybrydyzacji i wydłużania jest wyższa niż 57°C.

· Ponieważ enzym jest żaroodporny, zaleca się projektowanie starterów i sond o bardzo wysokich temperaturach topnienia (>60°C).

· Zaleca się optymalizację temperatury etapu wyżarzania/wydłużania poprzez gradient temperatury podczas procesu przygotowania reakcji.

· Im wyższa temperatura, tym wyższa specyficzność PCR.Cykl odwrotnej transkrypcji jest zwykle wykonywany w wyższej temperaturze niż cykl PCR, ponieważ hybrydyzacja DNA Primer:Matryca RNA ma zwykle wyższą temperaturę topnienia niż DNA Primer:cDNA Template duplex.

· Polimeraza DNA RevTaq RT-PCR jest genetycznie zmodyfikowana i zoptymalizowana, a wielkość amplikonu wynosi od 60 do 300 bp.

Granica wykrywalności polimerazy DNA RevTaq RT-PCR osiąga 4 kopie/

Zoptymalizowany system reakcji (ustanowienie starterów o wysokiej temperaturze topnienia) pokazano na rysunku.RevTaq RT-PCR RT-PCR sterowany polimerazą DNA wykazuje lepszą czułość niż 1-etapowa mieszanina główna RT-qPCR TaqPath i niższy gradient rozcieńczenia próbki.

Więcej zalet:

Funkcja szybkiego startu → Początkowy etap denaturacji termicznej można pominąć.

Formuła aptameru na gorąco → Zapewnia natychmiastową 100% aktywność enzymatyczną i zapobiega niespecyficznej amplifikacji w niskich temperaturach (<57°C).

Funkcja cięcia → Etap ekstrakcji RNA jest pominięty, ponieważ polimeraza DNA RevTaq RT-PCR może również przetwarzać surowe próbki reakcyjne.Może natychmiastowo zniszczyć błony komórkowe eukariontów, bakterii i wirusów w gorącym cyklu RT-PCR.

Poziom surowca IVD → wysokie standardy jakości i niezwykle konkurencyjne ceny