• Facebook
  • Linkedin
  • youtube

Specyfika wykrywania

W większości przypadków celem projektowania starterów jest maksymalizacja specyficzności PCR.Decyduje o tym mniej lub bardziej przewidywalny wpływ wielu zmiennych.Jedną z ważnych zmiennych jest sekwencja na końcu 3 startera.

Co ważne, testy PCR zaprojektowane pod kątem specyficzności z większym prawdopodobieństwem utrzymają wysoką wydajność w szerokim zakresie dynamicznym, ponieważ test nie wytwarza niespecyficznych produktów amplifikacji, konkurując w ten sposób z odczynnikami PCR lub hamując główną reakcję amplifikacji.

Oczywiście w niektórych przypadkach specyficzność nie jest najważniejsza, na przykład gdy celem jest ilościowe określenie blisko spokrewnionych, ale różnych patogenów, wymagane są specjalne standardy projektowania, optymalizacji i weryfikacji.

Krzywa topnienia jest standardową metodą oceny specyficzności amplikonów, przynajmniej jeśli chodzi o amplifikację pojedynczego celu.Należy jednak podkreślić, że krzywe topnienia mogą być mylące, ponieważ na przykład mogą na nie wpływać połączone efekty suboptymalnych starterów i niskich stężeń matrycy.

sadf

P5 |Krzywa topnienia pokazuje przesunięcia Tm otrzymane z dwóch detekcji różnych ilości dwóch docelowych DNA.

A. Przy wyższych stężeniach (ad)) po zakończeniu pomiaru qPCR nie ma oczywistego dimeru startera.Gdy stężenie matrycy spada do 50 kopii (e), zaczyna pojawiać się niespecyficzny produkt, który staje się jedynym produktem w najniższym stężeniu (f).

B. Test zarejestrował tę samą Tms przy wszystkich stężeniach docelowych i nie było oczywistego dimeru startera nawet przy najniższym stężeniu (5 kopii).Podczas stosowania tych dwóch metod wykrywania w NTC nie wykryto żadnych produktów amplifikacji.

P5 pokazuje krzywe rozpuszczania otrzymane dla próbek, w których matryca jest obecna w różnych stężeniach.P5a pokazuje, że przy dwóch najniższych stężeniach, Tms wytworzonych niespecyficznych produktów amplifikacji są niższe niż dla specyficznych amplikonów.

Oczywiście ta metoda wykrywania nie może być niezawodnie stosowana do wykrywania celów, które istnieją w niskich stężeniach.

Co ciekawe, NTC, tj. próbki w ogóle pozbawione DNA, nie zarejestrowały (nieswoistych) produktów amplifikacji, co wskazuje, że genomowe DNA tła może uczestniczyć w nieswoistej amplifikacji/polimeryzacji.

Czasami nie można zaradzić takim starterom tła i nieswoistej amplifikacji, ale często możliwe jest zaprojektowanie metody wykrywania, która nie ma nieswoistej amplifikacji w żadnym stężeniu matrycy i NTC (P 5b).

W tym przypadku nawet zarejestrowanie amplifikacji docelowego stężenia z Cq równym 35 da specyficzną krzywą rozpuszczania.Podobnie, NTC nie wykazywały oznak niespecyficznej amplifikacji.Czasami sposób wykrywania może być zależny od ługu macierzystego iw niektórych kompozycjach buforowych wykrywana jest tylko niespecyficzna amplifikacja, co może być związane z różnymi stężeniami Mg2+.

Stabilność wykrywania

Optymalizacja Ta jest użytecznym krokiem w empirycznej weryfikacji i procesie optymalizacji wykrywania qPCR.Zapewnia bezpośrednie wskazanie solidności zestawu starterów, pokazując temperaturę (lub zakres temperatur), która daje najniższe Cq bez wzmacniania NTC.

Dwu- do czterokrotna różnica w czułości może nie mieć znaczenia dla osób z wysoką ekspresją mRNA, ale dla testów diagnostycznych może oznaczać różnicę między wynikiem dodatnim a fałszywie ujemnym.

Właściwości Ta starterów qPCR mogą się znacznie różnić.Niektóre testy nie są bardzo solidne i jeśli nie zostaną przeprowadzone przy optymalnej wartości Ta starterów, szybko się załamią.

Jest to ważne, ponieważ ten rodzaj wykrywania jest często problematyczny w świecie rzeczywistym, a czystość próbki, stężenie DNA lub obecność innego DNA mogą nie być optymalne.

Ponadto docelowa liczba kopii może zmieniać się w szerokim zakresie, a odczynniki, plastikowe przybory lub instrumenty mogą różnić się od tych użytych podczas przygotowania testu.

faf

P6|Gradient temperatury pokazuje różną odporność wykrywania PCR.

A. Użyj Mastermixu Bioline Sensifast SYBR (numer katalogowy BIO-98050) do przeprowadzenia PCR na cDNA przygotowanym z RNA ludzkiego mózgu.

B. Za pomocą aparatu Bio-Rad CFX qPCR zarejestrować mapę amplifikacji i krzywą rozpuszczania apalenu (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. Wykres amplifikacji i krzywa topnienia ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Wykres amplifikacji i krzywa rozpuszczania GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cq zarejestrowane w różnych temperaturach wyżarzania, pokazujące różnicę w Cq zarejestrowaną przy gradiencie temperatury 7°C.

P 6 przedstawia typowy wynik niepożądanego testu, w którym przeprowadzono qPCR stosując gradient Tas między 59C a 67C (P 6a), stosując startery dla trzech genów specyficznych dla ludzkiego mózgu.

Z wykresu amplifikacji widać, że startery Opalin są dalekie od ideału, ponieważ ich optymalny zakres Ta jest bardzo wąski (Rysunek 6b), to znaczy Cqs są szeroko rozproszone, co powoduje, że Cqs są znacząco porównywane z ich optymalnym Cqs Low.

Ta metoda wykrywania jest niestabilna i może prowadzić do suboptymalnej amplifikacji.Dlatego ta para starterów powinna zostać przeprojektowana.Ponadto analiza krzywej topnienia (wstawka) pokazuje, że specyficzność tej metody wykrywania może być również problematyczna, ponieważ krzywa topnienia każdego Ta jest inna.

Metoda wykrywania ACSBG1 pokazana na P 6c jest bardziej niezawodna niż powyższa metoda wykrywania Opalin, ale wciąż jest daleka od ideału i prawdopodobnie można ją ulepszyć.

Podkreślamy jednak, że nie ma koniecznego związku między odpornością a specyficznością, ponieważ krzywa rozpuszczania wytworzona tą metodą wykrywania pokazuje tę samą wartość piku we wszystkich Tas (wstawka).

Z drugiej strony test solidności jest znacznie bardziej tolerancyjny, dając podobne Cq w szerokim zakresie Tas, jak w teście GFAP pokazanym w P 6d.

Różnica w Cqs uzyskana w tym samym zakresie 8 stopni Celsjusza jest mniejsza niż 1, a krzywa rozpuszczania (wstawka) potwierdza charakterystykę detekcji w tym zakresie temperatur.Warto zauważyć, że wyliczony Tas i rzeczywisty zakres Tas mogą się bardzo różnić.

Istnieje wiele wytycznych, które mają pomóc naukowcom w projektowaniu skutecznych starterów, z których większość opiera się na ustalonych od dawna zasadach, a wiele uwagi poświęcono końcówce 3 starterów.Często zaleca się włączenie G lub C na końcu 3' i dwóch zasad G lub C (zacisk GC), ale nie więcej niż dwie z ostatnich 5 zasad.

W praktyce zasady te mogą kierować badaczami, ale niekoniecznie są poprawne we wszystkich okolicznościach.

bezpieczny

P7 |Koniec 3' startera ma niewielki wpływ na specyficzność lub wydajność.

A. Pozycja starterów dla ludzkiego genu HIF-1α (NM_181054.2).

B. Użyj ługu macierzystego Agilent Brilliant III SYBR Green (nr kat. 600882) do amplifikacji sześciu pozycji testowych.

C. Wykres amplifikacji i krzywa topnienia zarejestrowana za pomocą instrumentu CFX qPCR firmy Bio-Rad i starterów na końcu 3'.NTC są pokazane na czerwono.

D. Zapis Cqs każdej pozycji testowej

Na przykład wynik w P 7 jest sprzeczny z regułą końca 3.Wszystkie projekty dają zasadniczo takie same wyniki, przy czym tylko dwie kombinacje starterów prowadzą do niespecyficznej amplifikacji w NTC.

Nie możemy jednak poprzeć efektu klipu GC, ponieważ w tym przypadku użycie A lub T jako maksymalnie 30 zasad nie zmniejsza specyficzności.

Test C, w którym starter F kończy się na GGCC, zarejestrował Cq w NTC, co wskazuje, że można chcieć uniknąć tych sekwencji na końcu 30.Podkreślamy, że jedynym sposobem określenia najlepszej sekwencji końca 3 pary starterów jest eksperymentalna ocena niektórych kandydujących starterów.

Wydajność amplifikacji

Co ważne, chociaż niespecyficzna detekcja PCR nigdy nie może stać się specyficzna, wydajność amplifikacji można dostosować i zmaksymalizować na wiele różnych sposobów, zmieniając enzym, ług macierzysty, dodatki i warunki cyklu.

Aby ocenić skuteczność detekcji PCR, najlepiej zastosować seryjne rozcieńczenia 10 lub 5-krotności docelowego kwasu nukleinowego, czyli „metodę krzywej wzorcowej”.

Jeśli do wygenerowania krzywej standardowej używane są amplikony PCR lub syntetyczne cele DNA, seryjne rozcieńczenia tych celów należy wymieszać ze stałą ilością DNA tła (takiego jak genomowy DNA).

fds

P8 |Krzywa rozcieńczenia do oceny wydajności PCR.

A. Użyj starterów dla HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA i R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC oraz Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (numer katalogowy 600882) do PCR i warunków krzywej topnienia.

B. 100 ng RNA poddano odwrotnej transkrypcji, rozcieńczono 2-krotnie, a seryjnie rozcieńczone próbki cDNA rozcieńczono 5-krotnie do 1 ng ludzkiego genomowego DNA.Krzywa topnienia jest pokazana we wstawce.

C. Reakcję RT, rozcieńczenie i seryjne rozcieńczenie powtórzono dla drugiej próbki cDNA, a wyniki były podobne.

P 8 pokazuje dwie krzywe wzorcowe, stosując tę ​​samą metodę wykrywania na dwóch różnych próbkach cDNA, wynik ma taką samą wydajność, około 100%, a wartość R2 jest również podobna, to znaczy stopień dopasowania między danymi eksperymentalnymi a linią regresji lub stopniem liniowości danych.

Dwie standardowe krzywe są porównywalne, ale nie dokładnie takie same.Jeżeli celem jest dokładne ilościowe określenie celu, należy zauważyć, że niedopuszczalne jest przedstawienie obliczenia liczby kopii bez wyjaśnienia niepewności

smutny

P9 |Niepewność pomiaru związana z kwantyfikacją przy użyciu krzywej wzorcowej.

A. Użyj starterów dla GAPDH (NM_002046), aby przeprowadzić PCR i warunki krzywej topnienia.F: ACAGTTGCCATGTAGACC i R: TAACTGGTTGAGCACAGG oraz Mastermix Sensifast SYBR firmy Bioline (numer katalogowy BIO-98050).

B. Wykres amplifikacji, krzywa topnienia i krzywa standardowa zarejestrowane za pomocą aparatu Bio-Rad CFX qPCR.

C. Wykres krzywej standardowej i 95% przedział ufności (CI).

D. Liczba kopii i 95% przedział ufności trzech wartości Cq pochodzących z krzywej rozcieńczenia.

P 9 pokazuje, że dla zoptymalizowanego testu, wrodzona zmienność pojedynczej krzywej wzorcowej jest około 2-krotna (95% przedział ufności, od minimum do maksimum), co może być najmniejszą zmiennością, jakiej można się spodziewać.

Powiązany produkt:

Zestaw Cell Direct RT qPCR

Zestaw do bezpośredniego PCR z ogonem myszy

Zestaw Animal Tissue Direct PCR


Czas postu: 30 września 2021 r