Moim zdaniem kilka rewolucyjnych wynalazków w historii technologii wykrywania to technologia znakowania immunologicznego oparta na zasadzie specyficznego wiązania antygen-przeciwciało, technologia PCR i technologia sekwencjonowania.Dzisiaj porozmawiamy o technologii PCR.Zgodnie z ewolucją technologii PCR, ludzie zwykle dzielą technologię PCR na trzy generacje: zwykłą technologię PCR, fluorescencyjną ilościową technologię PCR w czasie rzeczywistym i cyfrową technologię PCR.
Cpopularna technika PCR
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis wynalazł reakcję łańcuchową polimerazy (reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR) w 1983 roku. Mówi się, że kiedy prowadził swoją dziewczynę, nagle miał przebłysk inspiracji i pomyślał o zasadzie PCR (o korzyściach płynących z prowadzenia samochodu).Kary Mullis otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1993 roku. The New York Times skomentował: „Wysoce oryginalne i znaczące, niemal dzielące biologię na epoki przed i po PCR.
Zasada PCR: W katalizie polimerazy DNA nić macierzysta DNA jest używana jako matryca, a specyficzny starter jest używany jako punkt początkowy wydłużania, a nić potomna DNA komplementarna do macierzystej nici DNA jest kopiowana in vitro poprzez denaturację, hybrydyzację, wydłużanie i inne etapy.Jest to technologia amplifikacji syntezy DNA in vitro, która umożliwia szybką i specyficzną amplifikację dowolnego docelowego DNA in vitro.
Zalety zwykłego PCR
1.Klasyczna metoda, kompletne standardy międzynarodowe i krajowe
2.Niższy koszt odczynników do przyrządów
3.Produkty PCR można odzyskać do innych eksperymentów biologii molekularnej
Zalecana maszyna Foregene PCR: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Powiązane produkty: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Wady zwykłego PCR
1.łatwo zanieczyścić
2.uciążliwa operacja
3.tylko analiza jakościowa
4.Umiarkowana wrażliwość
5.Występuje niespecyficzna amplifikacja, a gdy niespecyficzny prążek ma taki sam rozmiar jak prążek docelowy, nie można go odróżnić
CPCR oparty na elektroforezie apillarnej
W odpowiedzi na wady zwykłego PCR, niektórzy producenci wprowadzili instrumenty oparte na zasadzie elektroforezy kapilarnej.Etap elektroforezy po amplifikacji PCR jest zakończony w kapilarze.Czułość jest wyższa i można rozróżnić różnicę kilku zasad, a amplifikację można obliczyć za pomocą MAERKER.zawartość produktu.Wadą jest to, że produkt PCR nadal wymaga otwierania i umieszczania w urządzeniu, a ponadto nadal istnieje duże ryzyko zanieczyszczenia.
CapillarnyEelektroforeza
2. Technologia fluorescencyjnego PCR w czasie rzeczywistym (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluorescencyjny ilościowy PCR, zwany także Real-Time PCR, to nowa technologia ilościowego kwasu nukleinowego opracowana przez PE (Perkin Elmer) w 1995 roku. Historia rozwoju fluorescencyjnego ilościowego PCR to historia poruszających duszę zmagań gigantów, takich jak ABI, Roche i Bio-Rad.Jeśli jesteś zainteresowany, możesz to sprawdzić.Ta technika jest obecnie najbardziej dojrzałą i szeroko stosowaną techniką półilościowego PCR.
Zalecana maszyna qPCR: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Metoda barwnika fluorescencyjnego (SYBR Green I):SYBR Green I jest najczęściej stosowanym barwnikiem wiążącym DNA do ilościowego PCR, który wiąże się nieswoiście z dwuniciowym DNA.W stanie wolnym SYBR Green emituje słabą fluorescencję, ale po związaniu z dwuniciowym DNA, jego fluorescencja wzrasta 1000-krotnie.Dlatego całkowity sygnał fluorescencyjny emitowany przez reakcję jest proporcjonalny do ilości obecnego dwuniciowego DNA i będzie wzrastał wraz ze wzrostem amplifikowanego produktu.Ponieważ barwnik wiąże się nieswoiście z dwuniciowym DNA, mogą być generowane wyniki fałszywie dodatnie.
Powiązane produkty: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Metoda sondy fluorescencyjnej (technologia Taqman): PodczasAmplifikacja PCR, specyficzna sonda fluorescencyjna jest dodawana w tym samym czasie co para starterów.Sonda jest liniowym oligonukleotydem, z fluorescencyjną grupą reporterową i fluorescencyjną grupą wygaszającą odpowiednio znakowanymi na obu końcach.Gdy sonda jest nienaruszona, sygnał fluorescencyjny emitowany przez grupę reporterową jest absorbowany przez grupę wygaszającą i wykrywanie Brak sygnału fluorescencyjnego;podczas amplifikacji PCR (w fazie wydłużania), aktywność 5'-3' Dicer enzymu Taq trawi i degraduje sondę, tak że reporterowa grupa fluorescencyjna i grupa fluorescencyjna wygaszacza są rozdzielone, tak że system monitorowania fluorescencji Sygnał fluorescencyjny może być odbierany, to znaczy za każdym razem, gdy łańcuch DNA jest amplifikowany, tworzona jest cząsteczka fluorescencyjna, co realizuje pełną synchronizację gromadzenia sygnałów fluorescencyjnych i tworzenia produktów PCR.Metoda sondy Taqman jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania w wykrywaniu klinicznym.
Powiązane produkty: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Zalety qPCR
1.Metoda jest dojrzała, a sprzęt pomocniczy i odczynniki są kompletne
2.Średni koszt odczynników
3.łatwy w użyciu
4.Wysoka czułość i swoistość wykrywania
Wady qPCR
Mutacja genu docelowego prowadzi do nieudanego wykrycia.
Nie można określić wyniku wykrywania matrycy o niskim stężeniu.
Podczas stosowania krzywej wzorcowej do wykrywania ilościowego występuje duży błąd.
3. Technologia Digital PCR (digital PCR, dPCR).
Cyfrowy PCR to technika bezwzględnego oznaczania ilościowego cząsteczek kwasu nukleinowego.W porównaniu z qPCR, cyfrowa PCR może bezpośrednio odczytać liczbę cząsteczek DNA/RNA, co jest bezwzględnym oznaczeniem ilościowym cząsteczek kwasu nukleinowego w próbce wyjściowej.W 1999 roku Bert Vogelstein i Kenneth W. Kin-zler formalnie zaproponowali koncepcję dPCR.
W 2006 roku firma Fluidigm jako pierwsza wyprodukowała komercyjny instrument dPCR oparty na chipie.W 2009 roku firma Life Technologies wprowadziła na rynek systemy OpenArray i QuantStudio 12K Flex dPCR.W 2013 roku firma Life Technologies uruchomiła system QuantStudio 3DdPCR, który wykorzystuje technologię chipów mikroprzepływowych w nanoskali o dużej gęstości do równomiernego rozprowadzania próbek do 20 000 pojedynczych komórek.w reakcji dobrze.
W 2011 roku Bio-Rad wprowadził na rynek kropelkowe urządzenie QX100 dPCR, które wykorzystuje technologię woda w oleju do równomiernego rozprowadzenia próbki do 20 000 kropel wody w oleju i wykorzystuje analizator kropelek do analizy kropelek.W 2012 roku firma RainDance wprowadziła na rynek instrument RainDrop dPCR, napędzany gazem pod wysokim ciśnieniem, w celu podzielenia każdego standardowego układu reakcyjnego na emulsję reakcyjną zawierającą od 1 miliona do 10 milionów mikrokropelek na poziomie pikolitra.
Do tej pory cyfrowy PCR utworzył dwie główne frakcje, typu chipowego i typu kropelkowego.Bez względu na rodzaj cyfrowej PCR, jej podstawowymi zasadami są ograniczone rozcieńczanie, PCR punktu końcowego i rozkład Poissona.Standardowy system reakcji PCR zawierający matryce kwasów nukleinowych jest równo podzielony na dziesiątki tysięcy reakcji PCR, które są rozdzielane na chipy lub mikrokrople, tak aby każda reakcja zawierała jak najwięcej cząsteczki matrycy i przeprowadzana była jednocząsteczkowa matrycowa reakcja PCR.Odczyt fluorescencji. Zlicza się obecność lub brak sygnału, a po kalibracji statystycznego rozkładu Poissona przeprowadza się bezwzględną ocenę ilościową.
Poniżej przedstawiono charakterystykę kilku cyfrowych platform PCR, z których korzystałem:
1. Cyfrowy PCR Bio-Rad QX200 kropelkowy Bio-RadQX200 to bardzo klasyczna cyfrowa platforma PCR, podstawowy proces wykrywania: 20 000 próbek jest generowanych przez generator kropel. Mikrokropelki woda w oleju są amplifikowane na zwykłej maszynie do PCR, a ostatecznie sygnał fluorescencji każdej mikrokropli jest odczytywany przez czytnik mikrokropelek.Operacja jest bardziej skomplikowana, a ryzyko zanieczyszczenia średnie.
Cyfrowy PCR mikrokropelkowy Xinyi TD1Xinyi TD1 to domowa cyfrowa platforma PCR, podstawowy proces wykrywania: wygeneruj 30 000-50 000 kropel wody w oleju za pomocą generatora kropel, amplifikuj na zwykłym urządzeniu do PCR, a na koniec przejdź. Czytnik kropel odczytuje sygnał fluorescencyjny każdej kropli.Zarówno generowanie kropel, jak i odczyt w tej platformie są wykonywane w dedykowanym chipie o niskim ryzyku kontaminacji.
STILLA Naica chip mikrokropelkowy do cyfrowego PCRSTILLA Naica to stosunkowo nowa platforma do cyfrowej reakcji PCR.Podstawowy proces wykrywania to: dodanie roztworu reakcyjnego do chipa, umieszczenie chipa w systemie generowania i amplifikacji mikrokropelek oraz wygenerowanie 30 000 mikrokropelek.Rozprowadź na chipie, a amplifikacja PCR zostanie zakończona na chipie.Następnie wzmocniony chip jest przekazywany do systemu analizy odczytu mikrokropel, a sygnał fluorescencyjny jest odczytywany poprzez robienie zdjęć.Ponieważ cały proces odbywa się w zamkniętym chipie, ryzyko zanieczyszczenia jest niskie.
4. Cyfrowy PCR z chipem ThermoFisher QuantStudio 3D
ThermoFisher QuantStudio 3D to kolejna klasyczna platforma do cyfrowego PCR oparta na chipach.Jego podstawowy proces wykrywania to: dodanie roztworu reakcyjnego do rozsiewacza i rozprowadzenie roztworu reakcyjnego równomiernie na chipie za pomocą 20 000 mikrodołków przez rozrzutnik., umieść chip na maszynie PCR w celu wzmocnienia, a na koniec włóż chip do czytnika i zrób zdjęcie, aby odczytać sygnał fluorescencyjny.Operacja jest stosunkowo skomplikowana, a cały proces odbywa się w zamkniętym chipie, a ryzyko zanieczyszczenia jest niewielkie.
5. Cyfrowy PCR JN MEDSYS Clarity chip
JN MEDSYS Clarity to stosunkowo nowa platforma do cyfrowego PCR typu chip.Jego podstawowy proces detekcji polega na: dodaniu roztworu reakcyjnego do aplikatora i rozprowadzeniu roztworu reakcyjnego równomiernie na 10 000 probówek PCR umocowanych w probówce PCR przez aplikator.Na mikroporowatym chipie roztwór reakcyjny wchodzi do chipa poprzez działanie kapilarne, a probówka do PCR z chipem jest umieszczana w maszynie do PCR w celu amplifikacji, a na koniec chip jest wkładany do czytnika w celu odczytania sygnału fluorescencyjnego poprzez zrobienie zdjęcia.Operacja jest bardziej skomplikowana.Ryzyko zanieczyszczenia jest niskie.
Parametry każdej cyfrowej platformy PCR podsumowano w następujący sposób:
Wskaźnikami oceny cyfrowej platformy PCR są: liczba jednostek podzielonych, liczba kanałów fluorescencyjnych, złożoność działania oraz ryzyko kontaminacji.Ale najważniejsza jest dokładność wykrywania.Jednym ze sposobów oceny cyfrowych platform PCR jest wykorzystanie wielu cyfrowych platform PCR do wzajemnej weryfikacji, a innym sposobem jest użycie standardowych substancji z dokładnymi wartościami.
Zalety dPCR
1.Osiągnięcie bezwzględnej kwantyfikacji
2.Wyższa czułość i specyficzność
3.Może wykrywać próbki o niskiej liczbie kopii
Wady dPCR1. Drogi sprzęt i odczynniki 2. Skomplikowana obsługa i długi czas detekcji 3. Wąski zakres detekcji
Obecnie trzy generacje technologii PCR mają swoje zalety i wady, a każda z nich ma swoje własne obszary zastosowań i nie jest to zależność polegająca na tym, że jedna generacja zastępuje drugą.Ciągły postęp technologiczny nadał technologii PCR nową żywotność, umożliwiając jej otwieranie kolejnych kierunków zastosowań, dzięki czemu wykrywanie kwasów nukleinowych jest wygodniejsze i dokładniejsze.
Źródło: Dr Yuan zabiera cię na testy
Rekomendowane produkty:
Czas postu: 18 listopada 2022 r
