PCR jest najczęściej stosowaną technologią amplifikacji kwasu nukleinowego i jest szeroko stosowana ze względu na swoją czułość i specyficzność.Jednak PCR wymaga wielokrotnej denaturacji termicznej i nie może pozbyć się ograniczeń związanych z poleganiem na instrumentach i sprzęcie, co ogranicza jego zastosowanie w klinicznych testach terenowych.

Od początku lat 90. wiele laboratoriów zaczęło opracowywać technologię amplifikacji w stałej temperaturze, która nie wymaga denaturacji termicznej.Teraz opracowali technologię amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli, technologię amplifikacji izotermicznej wymiany nici, technologię amplifikacji izotermicznej toczącego się koła oraz zależność sekwencji kwasu nukleinowego.Technologia wzmacniania izotermicznego i inne technologie. 

Lamplifikacja izotermiczna za pośrednictwem oop

Zasada amplifikacji opiera się na fakcie, że DNA znajduje się w stanie równowagi dynamicznej w temperaturze około 65°C.Kiedy jakikolwiek starter jest sparowany z zasadami i przedłużony do komplementarnej części dwuniciowego DNA, druga nić dysocjuje i staje się jednoniciowa.

W tej temperaturze DNA wykorzystuje 4 specyficzne startery, aby polegać na polimerazie DNA przemieszczającej nić, aby synteza DNA przemieszczającego nić przebiegała samoczynnie w sposób ciągły.

Najpierw określ 6 specyficznych regionów F3, F2, F1, B1, B2, B3 na docelowym genie, a następnie zaprojektuj 4 startery w oparciu o te 6 specyficznych regionów (jak pokazano na poniższym rysunku):

Wewnętrzny starter do przodu (FIP) składa się z F1c i F2.

Wewnętrzny starter wsteczny (BIP) składa się z B1c i B2, a TTTT jest używany jako przekładka w środku.

Zewnętrzne startery F3 i B3 składają się odpowiednio z regionów F3 i B3 genu docelowego.

W systemie reakcji LAMP stężenie startera wewnętrznego jest kilka razy większe niż startera zewnętrznego.Starter wewnętrzny jest najpierw łączony z nicią matrycową w celu zsyntetyzowania nici komplementarnej w celu utworzenia podwójnej nici DNA.Następnie zewnętrzny starter łączy się z nicią matrycy, tworząc podwójną nić DNA.Pod działaniem polimerazy BstDNA uwalniana jest komplementarna nić syntetyzowana przez starter wewnętrzny.Po serii reakcji komplementarna nić ostatecznie tworzy pojedynczą nić DNA o strukturze hantli.

Sama pojedyncza nić DNA struktury hantli jest używana jako szablon do ciągłego tworzenia przejściowej struktury DNA typu łodyżka-pętla z otwartym końcem.Wewnętrzne i zewnętrzne startery kierują DNA przejściowej struktury łodyżkowo-pętlowej, aby w sposób ciągły ulegało reakcjom przemieszczania i wydłużania nici, a ostatecznie tworzy wiele struktur łodyżkowo-pętlowych o różnych długościach.Mieszanka DNA.

Zalety i wady amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli

Zalety LAMPY:

(1) Wysoka wydajność amplifikacji, która może skutecznie amplifikować 1-10 kopii docelowego genu w ciągu 1 godziny, a wydajność amplifikacji jest 10-100 razy większa niż w przypadku zwykłego PCR.

(2) Czas reakcji jest krótki, specyficzność jest silna i nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt.

Wady LAMPY:

(1) Wymagania dotyczące podkładów są szczególnie wysokie.

(2) Zamplifikowany produkt nie może być użyty do klonowania i sekwencjonowania, ale może być użyty jedynie do oceny.

(3) Ze względu na dużą czułość łatwo tworzy aerozole, powodując fałszywe alarmy i wpływając na wyniki testu.

Swzmocnienie przesunięcia trand

Amplifikacja z przemieszczeniem nici (SDA) to technika amplifikacji izotermicznego DNA in vitro oparta na reakcji enzymatycznej, zaproponowana po raz pierwszy przez amerykańskiego uczonego Walkera w 1992 roku.

Podstawowy układ SDA obejmuje endonukleazę restrykcyjną, polimerazę DNA o aktywności przemieszczania nici, dwie pary starterów, dNTP, jony wapnia i magnezu oraz układy buforowe.

Zasada amplifikacji z przemieszczeniem nici opiera się na chemicznie zmodyfikowanej sekwencji rozpoznawanej przez endonukleazę restrykcyjną na obu końcach docelowego DNA.Endonukleaza otwiera lukę w nici DNA w miejscu rozpoznawania, a polimeraza DNA wydłuża koniec 3' przerwy i zastępuje następną nić DNA.

Zastąpione pojedyncze nici DNA można łączyć ze starterami i wydłużać w podwójne nici za pomocą polimerazy DNA.Proces ten jest powtarzany w sposób ciągły, tak że docelowa sekwencja jest wydajnie amplifikowana.

Zalety i wady technologii wzmacniania przesunięcia nici

Zalety SDA:

Wydajność amplifikacji jest wysoka, czas reakcji jest krótki, specyficzność jest silna i nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt.

Wady SDA:

Produkty nie są jednorodne, a niektóre produkty jednoniciowe i dwuniciowe są zawsze wytwarzane w cyklu SDA, a ogon nieuchronnie wystąpi po wykryciu przez elektroforezę.

Ramplifikacja koła ollinga

Proponowana amplifikacja toczącego się koła (RCA) opiera się na metodzie kopiowania DNA z organizmów chorobotwórczych za pomocą toczącego się koła.Odnosi się to do użycia jednoniciowego kolistego DNA jako matrycy w stałej temperaturze i specjalnej polimerazy DNA (takiej jak Phi29) ) Pod wpływem działania syntezy DNA toczącego się koła w celu uzyskania amplifikacji genu docelowego.

RCA można podzielić na wzmocnienie liniowe i wzmocnienie wykładnicze.Wydajność liniowego RCA może osiągnąć 10⁵razy, a wydajność wykładniczego RCA może osiągnąć 10⁹czasy.

Proste rozróżnienie, jak pokazano na poniższym rysunku, amplifikacja liniowa a wykorzystuje tylko 1 starter, amplifikacja wykładnicza b ma 2 startery.

Liniowy RCA jest również nazywany pojedynczym podkładem RCA.Starter wiąże się z kolistym DNA i jest wydłużany przez działanie polimerazy DNA.Produkt jest liniową pojedynczą nicią z dużą liczbą powtarzających się sekwencji, które są tysiące razy dłuższe niż pojedyncza pętla.

Ponieważ iloczyn liniowego RCA jest zawsze podłączony do podkładu początkowego, dużą zaletą jest łatwe utrwalanie sygnału.

Wykładniczy RCA, znany również jako hiperrozgałęziona amplifikacja HRCA (Hyper rozgałęziony RCA), w wykładniczym RCA jeden starter amplifikuje produkt RCA, drugi starter hybrydyzuje z produktem RCA i wydłuża się, a zamiennik jest już związany z produktem RCA. Kolejne startery wydłużają nić i powtarzają wydłużanie i wymianę, aby wytworzyć dendrytyczny produkt amplifikacji RCA.

Zalety i wady amplifikacji kwasu nukleinowego w toczącym się kole

Zalety RCA:

Wysoka czułość, dobra specyficzność i łatwa obsługa.

Wady RCA:

Problemy w tle podczas wykrywania sygnału.Podczas reakcji RCA sonda kłódkowata bez obiegu i matryca DNA lub RNA niezwiązanej sondy mogą generować pewne sygnały tła. 

Namplifikacja oparta na sekwencji kwasu ukleikowego

Amplifikacja oparta na sekwencji kwasu nukleinowego (NASBA) to nowa technologia opracowana na bazie PCR.Jest to ciągła i izotermiczna amplifikacja kwasu nukleinowego pod kontrolą pary starterów z sekwencją promotora T7.Technologia może amplifikować matrycowy RNA około 109 razy w ciągu około 2 godzin, czyli 1000 razy szybciej niż konwencjonalna metoda PCR i nie wymaga specjalnego sprzętu.

Ta technologia została wykorzystana do szybkiego diagnozowania chorób, gdy tylko się pojawiła, a wiele firm stosuje obecnie tę metodę w zestawach do wykrywania RNA.

Chociaż amplifikacja RNA może również wykorzystywać technologię PCR z odwrotną transkrypcją, NASBA ma swoje zalety: można ją przeprowadzić w stosunkowo stałych warunkach temperaturowych oraz jest bardziej stabilna i dokładna niż tradycyjna technologia PCR.

Reakcja zachodzi w temperaturze 41 stopni Celsjusza i wymaga do zakończenia odwrotnej transkryptazy AMV (wirus ptasiej mieloblastozy), RNazy H, polimerazy RNA T7 i pary starterów.

Proces obejmuje głównie:

Starter przedni zawiera komplementarną sekwencję promotora T7.Podczas reakcji starter przedni wiąże się z nicią RNA i jest katalizowany przez enzym AMV, tworząc podwójną nić DNA-RNA.

RNaza H trawi RNA w dwuniciowej hybrydzie i zatrzymuje jednoniciowy DNA.

Pod wpływem startera odwrotnego i enzymu AMV powstaje podwójna nić DNA zawierająca sekwencję promotora T7.

Pod działaniem polimerazy RNA T7 kończy się proces transkrypcji i powstaje duża ilość docelowego RNA.

Zalety NASBA:

(1) Jego starter ma sekwencję promotora T7, ale obcy dwuniciowy DNA nie ma sekwencji promotora T7 i nie może być amplifikowany, więc ta technologia ma wysoką specyficzność i czułość.

(2) NASBA bezpośrednio włącza proces odwrotnej transkrypcji do reakcji amplifikacji, skracając czas reakcji.

Wady NASBA:

(1) Składniki reakcji są bardziej skomplikowane.

(2) Aby zwiększyć koszt reakcji, potrzebne są trzy rodzaje enzymów.