Fluorescencyjny ilościowy PCR (znany również jako TaqMan PCR, zwany dalej FQ-PCR) to nowa technologia ilościowa kwasów nukleinowych opracowana przez PE (Perkin Elmer) w Stanach Zjednoczonych w 1995 roku. Technologia ta opiera się na konwencjonalnym PCR poprzez dodanie sond znakowanych fluorescencyjnie.W porównaniu z elastycznym PCR, FQ-PCR ma wiele zalet w realizacji swojej funkcji ilościowej.Ten artykuł ma na celu krótkie opisanie cech, zasad, metod i zastosowań tej technologii.
1 Funkcje
FQ-PCR ma nie tylko wysoką czułość zwykłego PCR, ale także dzięki zastosowaniu sond fluorescencyjnych może bezpośrednio wykrywać zmianę sygnału fluorescencyjnego podczas amplifikacji PCR poprzez fotoelektryczny system przewodzenia w celu uzyskania wyników ilościowych, co przezwycięża wiele niedociągnięć konwencjonalnego PCR, dzięki czemu ma również wysoką specyficzność hybrydyzacji DNA i wysoką dokładność technologii spektroskopii.
Na przykład ogólne produkty PCR należy obserwować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i barwienia bromkiem etydyny w świetle ultrafioletowym lub za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym i barwienia srebrem.Wymaga to nie tylko wielu instrumentów, ale także czasu i wysiłku.Stosowane plamy Bromek etydyny jest szkodliwy dla ludzkiego organizmu, a te skomplikowane procedury eksperymentalne stwarzają możliwości zanieczyszczenia i fałszywych alarmów.Jednak FQ-PCR wymaga tylko jednego otwarcia pokrywy podczas ładowania próbki, a następujący po niej proces to operacja całkowicie zamkniętej probówki, która nie wymaga przetwarzania końcowego PCR, co pozwala uniknąć wielu wad w konwencjonalnych operacjach PCR.Eksperyment generalnie wykorzystuje termocykler ABI7100 PCR opracowany przez firmę PE.
Instrument ma następujące cechy: ① Szerokie zastosowanie: może być stosowany do ilościowego oznaczania produktów PCR DNA i RNA, badań ekspresji genów, wykrywania patogenów i optymalizacji warunków PCR.② Unikalna zasada ilościowa: Używając sond znakowanych fluorescencyjnie, ilość fluorescencji będzie się kumulować wraz z cyklem PCR po wzbudzeniu laserem, aby osiągnąć cel oznaczania ilościowego.③ Wysoka wydajność pracy: Wbudowany termocykler 9600 PCR, sterowany komputerowo od 1 do 2 godzin w celu automatycznego i synchronicznego zakończenia amplifikacji i kwantyfikacji 96 próbek.④ Nie ma potrzeby elektroforezy żelowej: Nie ma potrzeby rozcieńczania i elektroforezy próbki, wystarczy użyć specjalnej sondy do wykrywania bezpośrednio w probówce reakcyjnej.⑤Brak zanieczyszczeń w rurociągu: przyjęto unikalną, całkowicie zamkniętą rurę reakcyjną i fotoelektryczny system przewodzenia, więc nie trzeba się martwić zanieczyszczeniem.⑥Wyniki są powtarzalne: ilościowy zakres dynamiczny wynosi do pięciu rzędów wielkości.Dlatego od czasu pomyślnego opracowania tej technologii jest ona doceniana przez wielu naukowców i znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach.
2 Zasady i metody
Zasada działania FQ-PCR polega na wykorzystaniu aktywności egzonukleazy 5′→3′ enzymu Taq w celu dodania sondy znakowanej fluorescencyjnie do systemu reakcji PCR.Sonda może specyficznie hybrydyzować z matrycą DNA zawartą w sekwencji startera.Koniec 5' sondy jest oznaczony genem emisji fluorescencji FAM (6-karboksyfluoresceina, pik emisji fluorescencji przy 518nm), a koniec 3' jest oznaczony grupą wygaszania fluorescencji TAMRA (6-karboksytetrametylorodamina, pik emisji fluorescencji przy 582nm), początek 3' sondy jest fosforylowany, aby zapobiec wydłużaniu sondy podczas amplifikacji PCR .Gdy sonda pozostaje nienaruszona, grupa wygaszacza tłumi emisję fluorescencji grupy emitującej.Po oddzieleniu grupy emitującej od grupy wygaszającej inhibicja zostaje zniesiona, a gęstość optyczna przy 518 nm wzrasta i jest wykrywana przez system detekcji fluorescencji. W fazie renaturacji sonda hybrydyzuje z matrycą DNA, a enzym Taq w fazie wydłużania porusza się wzdłuż matrycy DNA wraz z wydłużaniem startera.Gdy sonda zostanie odcięta, efekt wygaszania zostaje zwolniony, a sygnał fluorescencyjny zostaje uwolniony.Za każdym razem, gdy szablon jest kopiowany, sonda jest odcinana, czemu towarzyszy uwolnienie sygnału fluorescencyjnego.Ponieważ istnieje zależność jeden do jednego między liczbą uwolnionych fluoroforów a liczbą produktów PCR, technika ta może być wykorzystana do dokładnego określenia ilościowego matrycy.Instrument eksperymentalny na ogół wykorzystuje termocykler ABI7100 PCR opracowany przez firmę PE, ale można również użyć innych termocyklerów.Jeśli w eksperymencie używany jest system reakcji typu reakcja ABI7700, po zakończeniu reakcji wyniki ilościowe można bezpośrednio podać za pomocą analizy komputerowej.Jeśli używasz innych termocyklerów, musisz użyć detektora fluorescencji do pomiaru sygnału fluorescencji w probówce reakcyjnej w tym samym czasie, aby obliczyć RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ reprezentuje stosunek intensywności luminescencji grupy emisji fluorescencji probówki z próbką do intensywności luminescencji grupy wygaszania, RQ- reprezentuje stosunek dwóch w pustej probówce, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) reprezentuje wielkość zmiany sygnału fluorescencji podczas PCR. Po przetworzeniu danych można uzyskać wyniki ilościowe.Dzięki wprowadzeniu sond fluorescencyjnych znacznie poprawia się specyficzność eksperymentu.Konstrukcja sondy powinna generalnie spełniać następujące warunki: ①Długość sondy powinna wynosić około 20-40 zasad, aby zapewnić specyficzność wiązania.②Zawartość zasad GC wynosi od 40% do 60%, aby uniknąć powielania pojedynczych sekwencji nukleotydowych.③ Unikaj hybrydyzacji lub nakładania się starterów.④ Stabilność wiązania między sondą a matrycą jest większa niż stabilność wiązania między starterem a matrycą, więc wartość Tm sondy powinna być co najmniej o 5°C wyższa niż wartość Tm startera.Ponadto stężenie sondy, homologia między sondą a sekwencją matrycy oraz odległość między sondą a starterem mają wpływ na wyniki eksperymentu.
Produkty powiązane:
Chiny Real Time PCR Easyᴹ-Taqman Producent i dostawca |Foregene (foreivd.com)
Czas postu: 15-10-2021
