• Facebook
  • Linkedin
  • youtube

Weryfikacja działania starterów i sond we wczesnej fazie odczynników PCR oraz określenie najbardziej odpowiednich warunków reakcji to warunek konieczny płynnego przebiegu eksperymentów formalnych.

Jak więc musimy potwierdzić sondę startera na wczesnym etapie?

Główne wskaźniki to linia podstawowa, krzywa amplifikacji, wartość ct, wydajność amplifikacji, wykrywanie próbek o niskim stężeniu, CV itp.

Linia bazowa

Linią bazową jest linia pozioma na krzywej amplifikacji PCR.W pierwszych kilku cyklach reakcji amplifikacji PCR sygnał fluorescencji nie zmienia się zbytnio i tworzy linię prostą.Ta linia prosta jest linią bazową.

Podczas badania przesiewowego sond starterów do PCR należy zwrócić uwagę na to, czy linia podstawowa jest równa.Czystość stężenia sondy startera wpłynie na linię podstawową, na przykład powodując wzrost lub spadek linii podstawowej.Linia bazowa jest również bardzo intuicyjnym wskaźnikiem.
Analiza

Krzywa amplifikacji

Innym intuicyjnym wskaźnikiem jest kształt krzywej amplifikacji.Najlepiej jest mieć krzywą w kształcie litery S, aby uniknąć wtórnego wzmocnienia lub innych nieprawidłowych krzywych wzmocnienia.
zero

Wartość Ct

Liczba cykli odpowiadająca punktowi przegięcia od linii bazowej do wzrostu wykładniczego jest wartością Ct.

Dla tej samej próbki różne sondy starterów dają różne krzywe amplifikacji, a odpowiednia wartość Ct będzie zależała od wydajności amplifikacji i stopnia interferencji.Teoretycznie im mniejsza wartość Ct wybranej przez nas sondy primera, tym lepiej.

Analiza-3

Wydajność wzmocnienia

Jedną z najbardziej niezawodnych i stabilnych metod oceny wydajności amplifikacji PCR jest krzywa standardowa, która jest również powszechnie uznawana przez naukowców.Sposób obejmuje wykonanie serii próbek w celu kontrolowania względnej liczby docelowych szablonów.Próbki te są zwykle wykonywane przez seryjne rozcieńczenia stężonych roztworów podstawowych, najczęściej stosowane jest 10-krotne rozcieńczenie.Wykorzystując serię rozcieńczonych próbek, używając standardowego programu qPCR do amplifikacji w celu uzyskania wartości Cq, a na koniec narysować krzywą wzorcową zgodnie ze stężeniem każdej próbki i odpowiadającą jej wartością Cq, aby otrzymać równanie liniowe Cq= -klgX0+b oraz wydajność amplifikacji E=10(-1 /k)-1.Przy stosowaniu qPCR do analizy ilościowej wymagana jest wydajność amplifikacji w zakresie 90%-110% (3,6>k>3,1).

Analiza-4

Wykrywanie próbek o niskim stężeniu

Gdy stężenie próbki jest niskie, wskaźniki wykrywania różnych sond starterów są różne.Wybieramy 20 próbek o niskim stężeniu do replikacji, a system starter-sonda o najwyższym wskaźniku wykrywalności jest najlepszy.

Analiza-5

Współczynnik zmienności (CV)

Można wykryć 10 zduplikowanych próbek za pomocą różnych sond starterów zgodnie ze standardem linii odczynnika do wykrywania amplifikacji kwasów nukleinowych.

Analiza-6

Odczynniki ilościowe:
Dokładność
Dokładność w ramach jednej partii powinna spełniać: współczynnik zmienności (CV,%) wartości logarytmicznej badanego stężenia ≤5%.Gdy stężenie próbki jest niskie, współczynnik zmienności (CV,%) logarytmu stężenia wykrywanego wynosi ≤10%


Odczynniki jakościowe:
Dokładność
Dokładność w ramach jednej partii powinna spełniać:

(1) Współczynnik zmienności wartości Ct (CV,%) ≤5%

Ta sama próbka jest testowana równolegle 10 razy, a wyniki testu powinny być spójne


Czas postu: 18 września 2021 r