• Facebook
  • Linkedin
  • youtube

We wczesnej fazie epidemii, ze względu na szybki rozwój, szybka diagnoza podejrzanych pacjentów jest kluczem do zapobiegania COVID-19.Niektóre zatwierdzone odczynniki do wykrywania kwasów nukleinowych mają krótki czas opracowywania i występują problemy, takie jak pośpieszne potwierdzenie działania, niewystarczająca optymalizacja odczynników i duże różnice między partiami;Problemy różnych laboratoriów klinicznych w różnych aspektach procesu wykrywania kwasu nukleinowego mogą również wpływać na dokładność wyników wykrywania kwasu nukleinowego.W tym artykule skupimy się na kluczowych powiązaniach i punktach w obecnym wykrywaniu kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 oraz przeanalizujemy problemy związane z fałszywie ujemnym i pozytywnym ponownym badaniem laboratoryjnego wykrywania kwasu nukleinowego i niespójnościami klinicznymi.

Zasady wykrywania kwasu nukleinowego SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 to wirus RNA o sekwencji genomu około 29 kb, z 10 genami, który może skutecznie kodować 10 białek.Wirusy składają się z RNA i białka, a najbardziej zewnętrzną warstwą jest zewnętrzna powłoka złożona z lipidów i glikoprotein.Wewnątrz kapsyd białkowy otacza RNA, chroniąc w ten sposób łatwo degradowalny RNA (P1).

zfgd

P1 Struktura SARS-COV-2

Wirusy atakują komórki poprzez określone receptory na powierzchni komórki, powodując infekcję i wykorzystują komórki gospodarza do replikacji.

Zasadą wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego jest odsłonięcie wirusowego RNA przez lizat komórkowy, a następnie zastosowanie fluorescencyjnej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w czasie rzeczywistym do wykrycia.

Kluczem do zasady detekcji jest zastosowanie starterów i sond w celu uzyskania „dopasowania docelowego” sekwencji kwasów nukleinowych, czyli znalezienia sekwencji kwasu nukleinowego SARS-CoV-2, która różni się od innych wirusów około 30 000 zasad (podobieństwo kwasu nukleinowego do innych wirusów) obszar „niski”), zaprojektowanie starterów i sond.

Startery i sondy są wysoce dopasowane do określonego regionu kwasu nukleinowego SARS-CoV-2, to znaczy specyficzność jest bardzo silna.Gdy wynik amplifikacji fluorescencyjnej RT-PCR w czasie rzeczywistym badanej próbki jest pozytywny, dowodzi to obecności SARS-CoV-2 w próbce.Zobacz P2.

zfgd2

P2 Etapy oznaczania kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 (reakcja fluorescencyjna RT-PCR w czasie rzeczywistym)

Warunki i wymagania laboratorium do wykrywania kwasu nukleinowego SARS-CoV-2

Laboratoria testujące kwasy nukleinowe są najbardziej idealne do środowisk o ujemnym ciśnieniu i powinny zwracać uwagę na monitorowanie ciśnienia, utrzymywać przepływ powietrza i eliminować aerozole.Personel zajmujący się badaniem kwasów nukleinowych musi posiadać odpowiednie kwalifikacje, przejść odpowiednie szkolenie w zakresie reakcji łańcuchowej polimerazy i przejść pomyślnie ocenę.Laboratorium powinno być ściśle zarządzane, podzielone na strefy, a nieistotny personel ma surowy zakaz wstępu.Czysty obszar powinien być wentylowany i dezynfekowany na miejscu.Odpowiednie przedmioty są umieszczane w strefach, czyste i brudne są oddzielane, wymieniane na czas i odkażane na miejscu.Rutynowa dezynfekcja: Środek dezynfekujący zawierający chlor jest głównym rozwiązaniem dla większych obszarów, a 75% alkohol może być używany do małych obszarów.Dobrym sposobem radzenia sobie z aerozolami jest otwieranie okien w celu wentylacji, a dezynfekcję powietrza można przeprowadzić również za pomocą promieni ultrafioletowych, filtracji i dezynfekcji powietrza.

Kluczowe powiązania i parametry oznaczania kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 (real-time fluorescencyjny RT-PCR)

Chociaż laboratoria na ogół zwracają baczną uwagę na „wykrywanie” kwasu nukleinowego, w rzeczywistości „ekstrakcja” kwasu nukleinowego jest również jednym z kluczowych etapów skutecznego wykrywania, co jest ściśle związane z pobieraniem i przechowywaniem próbek wirusa.

Obecnie najczęściej stosowane próbki oddechowe, takie jak wymazy z jamy nosowo-gardłowej, wykorzystują drugą metodę, czyli roztwór inaktywujący (konserwujący) przygotowany na bazie roztworu do ekstrakcji i lizy kwasów nukleinowych.Z jednej strony ten roztwór do konserwacji wirusów może denaturować białko wirusa, tracić jego aktywność i nie być już zakaźny oraz poprawiać bezpieczeństwo etapu transportu i wykrywania;z drugiej strony może bezpośrednio złamać wirusa, aby uwolnić kwas nukleinowy, wyeliminować enzym rozkładający kwas nukleinowy i zapobiec wirusowi.RNA ulega degradacji.

Roztwór do pobierania próbek wirusa przygotowany na bazie roztworu do lizy ekstrakcji kwasu nukleinowego.Głównymi składnikami są zrównoważone sole, środek chelatujący kwasu etylenodiaminotetraoctowego, sól guanidyny (izotiocyjanian guanidyny, chlorowodorek guanidyny itp.), Anionowy środek powierzchniowo czynny (dodekan) siarczan sodu), kationowy środek powierzchniowo czynny (szczawian tetradecylotrimetyloamoniowy), fenol, 8-hydroksychinolina, ditiotreitol, proteinaza K i inne kilka lub więcej składników.Obecnie istnieje wiele rodzajów zestawów do ekstrakcji kwasu nukleinowego i stosuje się różne odczynniki do ekstrakcji i oczyszczania kwasu nukleinowego.Nawet jeśli używany jest ten sam odczynnik do ekstrakcji i oczyszczania kwasu nukleinowego, procedury ekstrakcji dla każdego zestawu są różne.

Obecnie produkty zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych zatwierdzone przez National Medical Products Administration są wybierane na podstawie genów ORF1ab, E i N w genomie SARS-CoV-2.Zasady wykrywania różnych produktów są zasadniczo takie same, ale ich startery i konstrukcje sond są różne.Istnieją segmenty z jednym celem (ORF1ab), segmenty z dwoma celami (ORF1ab, N lub E) i segmenty z trzema celami (ORF1ab, N i E).Różnica między wykrywaniem a interpretacją, ekstrakcją kwasu nukleinowego i systemem reakcji fluorescencyjnej RT-PCR w czasie rzeczywistym powinna odnosić się do odpowiednich instrukcji zestawu i zaleca się, aby użytkownicy ściśle przestrzegali metody interpretacji określonej w instrukcjach zestawu do interpretacji.Wspólne regiony, startery i sekwencje sond zamplifikowane przez fluorescencyjną reakcję RT-PCR w czasie rzeczywistym pokazano na P3.

zfgd3

P3 Lokalizacja docelowego amplikonu SARS-CoV-2 na genomie oraz sekwencja starterów i sond

Interpretacja wyników oznaczania kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 (Rtak-Time fluorescencyjny RT-PCR)

„Plan zapobiegania i kontroli zapalenia płuc w zakażeniu SARS-CoV-2 (wydanie drugie)” po raz pierwszy wyjaśnił kryteria oceny wyników amplifikacji pojedynczego genu:

1. Brak Ct lub Ct≥40 jest ujemny;

2. Ct<37 jest dodatnie;

3. Wartość Ct 37-40 to obszar w skali szarości.Zaleca się powtórzenie eksperymentu.Jeśli wynik ponownego wykonania Ct<40 i krzywa amplifikacji mają oczywiste piki, próbka jest oceniana jako pozytywna, w przeciwnym razie jest ujemna”.

Trzecia edycja przewodnika i czwarta edycja przewodnika kontynuowały powyższe kryteria.Jednak ze względu na różne tarcze stosowane w zestawach handlowych we wspomnianym III wydaniu poradnika nie podano kryteriów określania kombinacji tarcz, podkreślając, że pierwszeństwo mają instrukcje podane przez producenta.Począwszy od piątej edycji wytycznych wyjaśniono dwa cele, w szczególności kryteria oceny pojedynczego celu, który jest trudny do oceny.Oznacza to, że jeśli laboratorium chce potwierdzić, że przypadek jest pozytywny dla wykrycia kwasu nukleinowego SARS-CoV-2, musi być spełniony 1 z 2 warunków:

(1) Dwa cele SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) w tej samej próbce są pozytywne w teście fluorescencyjnej reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym.Jeśli pojedynczy cel jest pozytywny, wymagane jest ponowne pobranie próbki i ponowne przetestowanie.Jeśli wyniki testu są Jeśli pojedynczy cel jest nadal pozytywny, ocenia się go jako pozytywny.

(2) Dwie próbki wykonane metodą fluorescencyjnej reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym wykazały wynik dodatni dla pojedynczego celu lub dwie próbki tego samego typu wykazały wynik dodatni dla jednego celu, który można uznać za pozytywny.Wytyczne podkreślają jednak również, że negatywne wyniki badań kwasów nukleinowych nie mogą wykluczyć zakażenia SARS-CoV-2.Należy wykluczyć czynniki, które mogą powodować wyniki fałszywie ujemne, w tym słabą jakość próbek (próbki oddechowe z jamy ustnej i gardła i innych części), pobieranie próbek zbyt wcześnie lub zbyt późno, próbki nie były właściwie przechowywane, transportowane i przetwarzane, a sama technologia miała problemy (zmienność wirusa, hamowanie PCR) itp.

Przyczyny fałszywie ujemnych wyników w wykrywaniu SARS-CoV-2

Pojęcie „fałszywie ujemnego” badania kwasu nukleinowego, o którym obecnie mowa, często odnosi się do „fałszywie ujemnego wyniku”, w którym wyniki testu kwasu nukleinowego są niezgodne z objawami klinicznymi, to znaczy objawy kliniczne i wyniki badań obrazowych są wysoce podejrzane o COVID-19, ale testy kwasu nukleinowego są zawsze wielokrotnie „ujemne”.Centrum Laboratorium Klinicznego NFZ wyjaśniło „fałszywie ujemny” wynik testu SARS-CoV-2.

(1) W komórkach zakażonej osoby znajduje się pewna ilość wirusa.Istniejące dane wskazują, że po zakażeniu organizmu wirusem wirus dostaje się do gardła przez nos i usta, następnie do tchawicy i oskrzeli, a następnie dociera do pęcherzyków płucnych.Zakażona osoba przechodzi okres inkubacji, łagodne objawy, a następnie proces ciężkich objawów i różne stadia choroby.A ilość wirusa obecnego w różnych częściach ciała jest różna.

Pod względem obciążenia wirusowego typów komórek, komórki nabłonka pęcherzyków płucnych (dolne drogi oddechowe)> komórki nabłonka dróg oddechowych (górne drogi oddechowe)> fibroblasty, komórki śródbłonka i makrofagi itp.;z rodzaju próbki płyn z płukania pęcherzyków płucnych (najdoskonalszy)> plwocina z głębokim kaszlem> wymaz z nosogardzieli> wymaz z jamy ustnej i gardła> krew.Ponadto wirusa można wykryć również w kale.Jednak biorąc pod uwagę wygodę operacji i akceptację pacjentów, powszechnie stosowaną kolejnością pobierania próbek klinicznych jest wymaz z jamy ustnej i gardła>wymaz z nosogardzieli>płyn z płukania oskrzeli (operacja skomplikowana) i plwocina głęboka (zwykle suchy kaszel, trudny do uzyskania).

Dlatego ilość wirusa w komórkach jamy ustnej i gardła niektórych pacjentów jest niewielka lub bardzo niska.Jeśli do badania zostaną pobrane tylko próbki jamy ustnej i gardła lub nosogardzieli, wirusowy kwas nukleinowy nie zostanie wykryty.

(2) Podczas pobierania próbek nie pobrano żadnych komórek zawierających wirusa lub wirusowy kwas nukleinowy nie został skutecznie zakonserwowany.

[① Niewłaściwe miejsce pobrania, na przykład podczas pobierania wymazów z jamy ustnej i gardła, głębokość pobierania nie jest wystarczająca, pobrane wymazy z nosogardzieli nie są pobierane głęboko w jamie nosowej itp. Większość pobranych komórek może być komórkami wolnymi od wirusów;

②Wymazówki do pobierania próbek są używane nieprawidłowo.Na przykład, jako materiał główki wacika zalecane są włókna syntetyczne, takie jak włókno PE, włókno poliestrowe i włókno polipropylenowe.Włókna naturalne, takie jak bawełna, są używane w rzeczywistych operacjach (silna adsorpcja białka i niełatwe do wypłukania) oraz włókna nylonowe (słaba absorpcja wody, prowadząca do niewystarczającej objętości próbki);

③Niewłaściwe użycie probówek do przechowywania wirusów, na przykład niewłaściwe użycie plastikowych probówek do przechowywania z polipropylenu lub polietylenu, które łatwo wchłaniają kwasy nukleinowe (DNA/RNA), co powoduje spadek stężenia kwasu nukleinowego w roztworze do przechowywania.W praktyce do przechowywania wirusowych kwasów nukleinowych zaleca się stosowanie plastikowych polimerów polietylenowo-propylenowych oraz niektórych pojemników z polipropylenu poddanych specjalnej obróbce.]

[① Niewłaściwe miejsce pobrania, na przykład podczas pobierania wymazów z jamy ustnej i gardła, głębokość pobierania nie jest wystarczająca, pobrane wymazy z nosogardzieli nie są pobierane głęboko w jamie nosowej itp. Większość pobranych komórek może być komórkami wolnymi od wirusów;

②Wymazówki do pobierania próbek są używane nieprawidłowo.Na przykład, jako materiał główki wacika zalecane są włókna syntetyczne, takie jak włókno PE, włókno poliestrowe i włókno polipropylenowe.Włókna naturalne, takie jak bawełna, są używane w rzeczywistych operacjach (silna adsorpcja białka i niełatwe do wypłukania) oraz włókna nylonowe (słaba absorpcja wody, prowadząca do niewystarczającej objętości próbki);

③Niewłaściwe użycie probówek do przechowywania wirusów, na przykład niewłaściwe użycie plastikowych probówek do przechowywania z polipropylenu lub polietylenu, które łatwo wchłaniają kwasy nukleinowe (DNA/RNA), co powoduje spadek stężenia kwasu nukleinowego w roztworze do przechowywania.W praktyce do przechowywania wirusowych kwasów nukleinowych zaleca się stosowanie plastikowych polimerów polietylenowo-propylenowych oraz niektórych pojemników z polipropylenu poddanych specjalnej obróbce.]

(4) Działanie laboratorium klinicznego nie jest wystandaryzowane.Warunki transportu i przechowywania próbek, ustandaryzowana praca laboratoriów klinicznych, interpretacja wyników i kontrola jakości to kluczowe czynniki zapewniające dokładność i wiarygodność wyników badań.Zgodnie z wynikami zewnętrznej oceny jakości przeprowadzonej przez Centrum Laboratoriów Klinicznych NFZ w dniach 16-24 marca 2020 r., spośród 844 laboratoriów, które uzyskały ważne wyniki, 701 (83,1%) zostało zakwalifikowanych, a 143 (16,9%) nie.Kwalifikowane, ogólne warunki badań laboratoryjnych są dobre, ale różne laboratoria nadal mają różnice w zdolności operacyjnej personelu, zdolności interpretacji pozytywnej próbki pojedynczego celu i kontroli jakości.

Jak zmniejszyć fałszywie ujemny wynik wykrywania kwasu nukleinowego SARS-CoV-2?

Zmniejszenie liczby wyników fałszywie ujemnych w wykrywaniu kwasu nukleinowego powinno być zoptymalizowane pod kątem czterech aspektów wytwarzania wyników fałszywie ujemnych.

(1) W komórkach zakażonej osoby znajduje się pewna ilość wirusa.Stężenie wirusa w różnych częściach ciała osób podejrzanych o zakażenie będzie różne w różnych momentach.Jeśli nie ma gardła, może znajdować się w płynie z płukania oskrzeli lub kale.Jeśli w tym samym czasie lub na różnych etapach rozwoju choroby można pobrać do badań wiele rodzajów próbek, pomoże to uniknąć wyników fałszywie ujemnych.

(2) Komórki zawierające wirusa należy pobrać podczas pobierania próbki.Problem ten można w dużej mierze rozwiązać poprzez wzmocnienie szkolenia pobierających próbki.

(3) Niezawodne odczynniki IVD.Prowadząc badania nad oceną skuteczności detekcji odczynników na poziomie krajowym i dyskutując istniejące problemy, można jeszcze poprawić skuteczność detekcji odczynników i poprawić czułość analizy.

(4) Standaryzacja działania laboratoriów klinicznych.Poprzez wzmacnianie szkoleń personelu laboratoryjnego, ciągłe doskonalenie systemu zarządzania jakością w laboratorium, zapewnianie rozsądnych podziałów oraz doskonalenie zdolności wykrywania personelu, możliwe jest ograniczenie liczby wyników fałszywie ujemnych wynikających z niewłaściwej działalności laboratorium.

Przyczyny ponownego pozytywnego wyniku testu kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 u pacjentów wyzdrowiałych i wypisanych

„Plan diagnozy i leczenia COVID-19 (wydanie siódme badania)” wyraźnie stanowi, że jednym z kryteriów wyleczenia i wypisania ze szpitala pacjentów z COVID-19 jest ujemny wynik testu kwasu nukleinowego w dwóch kolejnych próbkach dróg oddechowych (w odstępie co najmniej 24 godzin), ale jest ich bardzo mało. Test kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 był ponownie dodatni u pacjentów wypisywanych z różnych powodów.

(1) SARS-CoV-2 to nowy wirus.Konieczne jest dalsze poznanie mechanizmu jej patogenezy, pełnego obrazu wywołanej choroby oraz charakterystyki przebiegu choroby.Dlatego z jednej strony konieczne jest wzmocnienie postępowania ze wypisywanymi pacjentami i prowadzenie 14-dniowej obserwacji lekarskiej.Przeprowadzaj obserwacje, monitorowanie stanu zdrowia i wytyczne zdrowotne, aby pogłębić zrozumienie całego procesu występowania, rozwoju i skutków choroby.

(2) Pacjent może być ponownie zakażony wirusem.Akademik Zhong Nanshan powiedział: Ponieważ wyleczeni pacjenci mają przeciwciała, SARS-CoV-2 może zostać wyeliminowany przez przeciwciała, gdy ponownie zaatakują.Istnieje wiele przyczyn, które mogą być przyczyną wyzdrowienia pacjenta lub mogą być związane z mutacją wirusa, a nawet przyczyną badań laboratoryjnych.Jeśli jest to sam wirus, mutacja SARS-CoV-2 może spowodować, że przeciwciało wytwarzane przez wyzdrowiałego pacjenta będzie nieskuteczne przeciwko zmutowanemu wirusowi.Jeśli pacjent zostanie ponownie zakażony zmutowanym wirusem, test kwasu nukleinowego może być ponownie dodatni.

(3) Jeśli chodzi o metody badań laboratoryjnych, każda metoda badań ma swoje ograniczenia.Wykrywanie kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 wynika z wyboru sekwencji genu, składu odczynników, czułości metody i innych powodów, które powodują, że istniejące zestawy mają swoje własne dolne granice wykrywalności.Po leczeniu pacjenta wirus w organizmie zmniejsza się.Gdy miano wirusa w badanej próbce spadnie poniżej dolnej granicy wykrywalności, pojawi się wynik „negatywny”.Wynik ten nie oznacza jednak, że wirus w organizmie całkowicie zniknął.Wirus może być po przerwaniu leczenia.Odrodzenie”, kopiuj dalej.Dlatego zaleca się przeprowadzanie przeglądu raz w tygodniu w ciągu 2 do 4 tygodni po wypisie.

(4) Kwas nukleinowy jest materiałem genetycznym wirusa.Wirus jest zabijany po poddaniu pacjenta leczeniu przeciwwirusowemu, ale pozostałe wirusowe fragmenty RNA są nadal zatrzymywane w ludzkim ciele i nie są całkowicie usuwane z organizmu.Czasami, w pewnych okolicznościach, może być bardziej zachowany.Długo iw tym czasie test kwasu nukleinowego będzie „przejściowo” pozytywny.Wraz z wydłużaniem się czasu rekonwalescencji pacjenta, po stopniowym wyczerpaniu zalegających w organizmie fragmentów RNA, wynik testu kwasu nukleinowego może być ujemny.

(5) Wynik testu kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 dowodzi jedynie obecności lub braku wirusowego RNA i nie może udowodnić aktywności wirusa ani tego, czy wirus jest przenoszony.Konieczne jest udowodnienie, czy pacjent, u którego ponownie wykryto kwasy nukleinowe, ponownie stanie się źródłem zakażenia.Konieczne jest przeprowadzenie hodowli wirusa na próbkach klinicznych i wyhodowanie „żywego” wirusa, aby udowodnić, że jest zakaźny.

Streszczenie

Podsumowując, nie można całkowicie uniknąć fałszywie ujemnych wyników testu na kwas nukleinowy SARS-CoV-2, ponownego pozytywnego wyniku testu i innych stanów, które są niezgodne z objawami klinicznymi.W rzeczywistych badaniach przesiewowych i testach zaleca się łączenie objawów klinicznych, badań obrazowych (CT) i eksperymentów Wyniki badań laboratoryjnych (test kwasu nukleinowego + test przeciwciał swoistych dla wirusa) w celu uzyskania kompleksowej diagnozy, aby zapobiec pominięciu diagnozy i błędnej diagnozie.W przypadku stwierdzenia ewidentnej niezgodności wyników testu z objawami klinicznymi, zaleca się przeprowadzenie kompleksowej analizy całego ogniwa testowego (połączeń pobierania próbek, krążenia i przetwarzania), aby wykluczyć wczesną infekcję wirusem SARS-CoV-2, infekcję nawracającą lub połączoną z innymi infekcjami wirusowymi układu oddechowego itp.Jeśli pozwalają na to warunki, zaleca się pobranie bardziej wrażliwych próbek, takich jak plwocina lub płyn z płukania pęcherzyków płucnych do ponownego zbadania.

Produkty powiązane:

Zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego SARS-CoV-2 (metoda multipleksowej sondy fluorescencyjnej PCR)


Czas postu: 03-09-2021